Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Expressão e purificação de anticorpos
- Manutenção de células de ovário de hamster chinês (CHO)
- Cultive células CHO em FreeStyle CHO Media suplementado com suplemento de glutamina 1x disponível comercialmente a 37 °C agitando a 130 rpm com 5% de CO2 usando frascos Erlenmeyer delong de vidro ou descartáveis.
nota: É altamente recomendável usar um frasco defletor com tampa ventilada para aumentar a agitação e melhorar a transferência de gás durante as condições de agitação. O rendimento de anticorpos significativamente reduzido foi obtido com frascos regulares (não defletores) devido à agitação limitada da cultura em suspensão.
- Mantenha o número de células entre 1-5 x 106 células/mL com >95% de viabilidade celular. Se o número de células aumentar mais de 5 x 106 células/mL, divida as células. Nunca permita que as células CHO atinjam menos de 0,2 x 106 células/mL.
- Transfecção de células CHO
- Cultive células CHO em 200 mL de meio (2 x 106 células/mL) em frascos defletores Erlenmeyer delongos.
nota: As culturas em suspensão cultivadas em frascos defletores sempre produziram maiores rendimentos de proteína do que quando cultivadas em frascos não defletores.
- Em um tubo de 15 mL, pegue 5 mL de meio CHO FreeStyle e adicione 50 μg de DNA de clone VH e 75 μg de DNA de clone VL. Vórtice para misturar bem.
- Incubar a mistura de DNA em temperatura ambiente por 5 min.
nota: A incubação mais longa reduz a produção de proteínas.
- Adicione 750 μL de estoque de polietilenoimina (PEI) de 1 mg / mL à solução de DNA e agite agressivamente a mistura por 30 s. Incube em temperatura ambiente por mais 5 min.
nota: O PEI deve ser feito fresco. Vários ciclos de congelamento e descongelamento de PEI reduzem significativamente o rendimento geral.
- Adicione toda a mistura de DNA e PEI às células enquanto agita manualmente o frasco. Incubar imediatamente os frascos defletores de Erlenmeyer delongos, com células a 37 °C agitando a 130 rpm.
- Expressão
nota: O anticorpo tem um peptídeo sinal secretor projetado para sua extremidade N-terminal, que ajuda os anticorpos a serem secretados no meio.
- Cultive as células transfectadas a 37 ° C, com agitação a 130 rpm no Dia 1.
- No dia 2, adicione 2 mL de agente antiaglomerante 100x e 2 mL de solução antibacteriana-antimicótica 100x. Deslocar o balão para uma temperatura mais baixa (32-34 °C), com agitação a 130 rpm.
- A cada cinco dias, adicione 10 mL de ração Tryptone N1 e 2 mL de suplemento de glutamina 100x.
- Continue contando as células a cada três dias usando um hemocitômetro depois de corar uma alíquota de células com uma coloração azul de tripano. Certifique-se de que a viabilidade celular fique acima de 80%.
- No dia 10 ou 11, colha o meio para purificação de anticorpos. Centrifugar a cultura a 3000 x g, 4 °C durante 40-60 min e, em seguida, filtrar o meio transparente com filtros de garrafa de 0,22 μM.
- Purificação
nota: A purificação de anticorpos é realizada usando uma coluna de Proteína-A disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais), usando uma bomba peristáltica.
- Equilibre a coluna com o volume de duas colunas de tampão de ligação (fosfato de sódio 20 mM a pH 7,4).
- Passar o meio filtrado contendo o anticorpo (obtido na etapa 1.3.5) através da coluna a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
- Lave a coluna com o volume de duas colunas do buffer de associação.
- Eluir o anticorpo em fracções de 500 μL utilizando 5 ml de tampão de eluição (30 mM de acetato de sódio a pH 3,4).
- Neutralize o pH do anticorpo eluído adicionando 10 μL de tampão de neutralização (acetato de sódio 3 M a pH 9) por fração.
nota: A fração número 3-6 contém a maior parte do anticorpo. É aconselhável manter todas as frações no caso de o anticorpo ser eluído numa fração posterior à esperada.
- Meça a concentração de anticorpos purificados usando um espectrofotômetro selecionando o protocolo padrão para imunoglobulina G (IgG). A concentração final do anticorpo é obtida em mg/mL considerando o peso molecular e o coeficiente de absorção.
2. Rotulagem fluorescente
NOTA: Os anticorpos são marcados com o corante infravermelho que contém um grupo reativo de éster NHS, que se acopla a proteínas e forma um conjugado estável. Essa reação é sensível ao pH e funciona melhor em pH 8,5. Os conjugados fluorescentes marcados com o corante exibem uma absorção máxima de 774 nm e uma emissão máxima de 789 nm. O pH 8,5 é a chave para uma conjugação eficaz.
- Dialisar 0,5 mL do anticorpo usando um de diálise (0,1-0,5 mL) em 1 L de tampão de conjugação (tampão fosfato 50 mM em pH 8,5). Após 4 h, transfira o de diálise para um novo tampão e dialise durante a noite.
- Configure uma reação de conjugação adicionando 0,03 mg de IRDye 800CW por 1 mg de anticorpo em um volume de reação de 500 μL.
nota: O IRDye 800CW é dissolvido em DMSO na concentração de 10 mg/mL.
- Realizar reações de rotulagem por 2 h a 20 °C.
nota: Aumentar o tempo além de 2 horas não melhora a rotulagem.
- Purifique os conjugados marcados por diálise extensiva contra 1x PBS.
- Estime o grau de marcação medindo a absorbância do corante a 780 nm e a absorbância da proteína a 280 nm. A contribuição do corante para o sinal de 280 nm é de 3%.
- Calcule a proporção corante/proteína usando esta fórmula:
onde 0,03 é um fator de correção para a absorbância do corante usado a 280 nm (igual a 3,0% de sua absorbância a 780 nm), εDye e εProtein são coeficientes de extinção molar para o corante e a proteína (anticorpo), respectivamente.
NOTA: εDye é 270.000 M-1 cm-1 e εProtein é 203.000 M-1 cm-1 (para um IgG típico) em uma mistura 1:1 de PBS: metanol. Outras proteínas além da IgG podem ter coeficientes de extinção molar muito diferentes. O uso do coeficiente de extinção correto para a proteína de interesse é essencial para a determinação precisa da relação D/P.
- Calcule a concentração final de proteína usando esta fórmula:
nota: Sempre confirme a eficácia de ligação ao antígeno de anticorpos marcados e não marcados usando ELISA (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática) ou citometria de fluxo antes de prosseguir para estudos in vivo.
3. Estudos de xenoenxerto em camundongos
- Preparação de células tumorais para injeção
- Cultive células OVCAR-3 em meio RPMI-1640, suplementado com 10% de FBS e 1x penicilina-estreptomicina.
- No dia anterior à injeção, subcultive as células em novas placas de cultura de 100 mm com 10 mL de meio/placa completos. Use o número da célula de 0,5-1 x 106 células/prato.
- Incubar culturas a 37 ° C de temperatura, 95% de umidade e 5% de CO2 por 20-24 h.
- No dia da injeção, remova o meio de crescimento das placas de cultura. Enxágue bem a camada celular com solução salina tamponada com fosfato de Ca2+/Mg2+ livre de Dulbecco (DPBS) para remover células mortas, detritos celulares e todos os vestígios de soro, que podem interferir na ação da tripsina.
- Tripsinize as células adicionando 1,0-1,5 mL de solução de tripsina-EDTA a cada placa e tente espalhar a solução inclinando a placa ao redor, seguida de incubação a 37 ° C por 5-10 min.
nota: Observe as células sob um microscópio invertido para verificar o status real da tripsinização. A tripsinização resulta em um menor número de células que se desprendem da superfície da placa de cultura, a tripsinização excessiva induz estresse celular. Portanto, a tripsinização adequada é importante.
- Adicione 1,0-1,5 mL de meio de crescimento completo a cada placa para interromper a ação da tripsina, depois disso, ressuspenda as células pipetando suavemente.
nota: A pipetagem suave é importante para manter a saúde celular.
- Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL e gire a 250 x g por 5 min em temperatura ambiente.
- Colete o pellet celular após remover o sobrenadante e lave as células ressuspendendo o pellet em 1x DPBS.
- Gire a suspensão da célula a uma velocidade baixa de 250 x g por 5 min.
- Adicione 500 μL de DPBS e ressuspenda as células por pipetagem suave para obter uma suspensão de célula única.
- Conte as células usando um hemocitômetro ou contador de células automatizado.
nota: Para melhor precisão, repita a contagem três vezes e faça uma média.
- Ajuste o volume de forma que a densidade celular final seja de 1 x 108 células/mL.
- Injeção subcutânea de células para desenvolvimento de xenoenxertos de camundongos
nota: Todos os procedimentos devem ser feitos em um gabinete de segurança BSL2. Camundongos Athymic Nude Foxn1nu / Foxn1+ foram usados no presente estudo.
- Pegue 50 μL da suspensão celular em um tubo de 1,5 mL e misture com 50 μL de meio de matriz de membrana basal.
nota: O meio da matriz da membrana basal tende a formar um estado semelhante a um gel à temperatura ambiente, portanto, mantenha cuidadosamente as células e a mistura do meio da matriz no gelo. É aconselhável manter tubos, pontas e seringas na geladeira e depois transferi-los para o gelo antes da injeção do animal.
- Agite a mistura para evitar qualquer aglomeração celular. Em seguida, pegue esses 100 μL da mistura de meio de suspensão celular e matriz que contém 5 x 106 células, em uma seringa de 1 cc.
- Levante suavemente a pele do animal para separar a pele da camada muscular subjacente e injete lentamente a suspensão celular (100 μL) sob a pele (5 x 106 células), com uma agulha de 26 G. Aguarde alguns segundos antes de retirar a agulha, para que o meio da matriz basal possa formar a estrutura semi-sólida semelhante a um gel junto com as células sob a pele, evitando que a mistura saia do local da injeção.
nota: As células precisam ser testadas antes da injeção para qualquer contaminação que possa prejudicar camundongos imunodeficientes. Durante a injeção, não coloque a agulha muito fundo na pele, pois isso pode formar o tumor mais profundo do que o esperado.
- Mantenha o animal em uma gaiola estéril e observe por cerca de 20 min.
- Observe os camundongos por 2-3 semanas e permita que o tumor cresça até 500 mm3 de tamanho.
4. Localização de anticorpos usando um sistema de imagem in vivo
NOTA: O equipamento de imagem in vivo (ver Tabela de Materiais) usado neste experimento usa um conjunto de filtros de alta eficiência e algoritmos de desmistura espectral para visualização não invasiva e rastreamento da atividade celular e genética dentro de um organismo vivo em tempo real. O sistema fornece capacidade de monitoramento de fluorescência e bioluminescência.
- Injete 25 μg de anticorpo marcado com corante através da veia da cauda.
- Anestesiar camundongos portadores de tumor usando isoflurano a 2%. Verifique a falta de resposta aos reflexos dos pedais.
- Assim que os ratos pararem de se mover, dilate a veia lateral da cauda aplicando água de verme.
- Injete 25 μg (em 100 μL) de anticorpo marcado usando uma seringa de insulina de 1 cc com uma agulha de 26 G.
- Da mesma forma, como controle negativo, rotule e injete o anticorpo não específico do isotipo IgG1 que não tem como alvo as células cancerígenas.
- Realize imagens ao vivo in vivo após 8, 24, 48 h, etc. de injeções de anticorpos.
- No software associado, clique em Inicializar localizado no painel de controle e confirme se a temperatura do estágio é de 37 °C.
- Ligue o suprimento de oxigênio, todas as bombas do sistema de anestesia e o suprimento de gás isoflurano para a câmara anestésica e ajuste a válvula vaporizadora de isoflurano para 2%.
- Transfira os camundongos para a câmara anestésica e espere até que os camundongos estejam completamente anestesiados. Aplique a pomada lubrificante para os olhos para evitar o ressecamento dos olhos.
- Vá para o painel de controle, configure a imagem de fluorescência através da opção Imaging Wizard e selecione a excitação em 773 nm e a emissão em 792 nm.
nota: As configurações padrão de exposição automática fornecem uma boa imagem fluorescente. No entanto, as preferências de exposição automática podem ser modificadas de acordo com as necessidades.
- Transfira os camundongos anestesiados para a câmara de imagem e monte-os no campo de imagem usando um cone nasal. O estágio de imagem oferece a opção de acomodar 5 camundongos por vez.
nota: Faça com que os mouses de controle sejam fotografados junto com os mouses de teste para ter uma quantidade semelhante de exposição e outras configurações durante a análise.
- Quando tudo estiver pronto, selecione a opção Adquirir no painel de controle para a aquisição da imagem.
- Com as configurações de exposição automática, o sistema gera a imagem em um minuto. A imagem gerada é a sobreposição de fluorescência na imagem fotográfica com intensidade de fluorescência óptica exibida em unidades de contagens ou fótons ou termos de eficiência.
- Depois de adquirir a imagem, transfira os camundongos da câmara de imagem de volta para sua gaiola e observe sua recuperação por 1 a 2 min.
- Ajuste ainda mais a imagem com as ferramentas e funções fornecidas no software para análise de imagens. As ferramentas de análise de imagem estão na barra de menus e na paleta de ferramentas.
- Em Ajuste de imagem, ajuste o brilho, o contraste ou a opacidade e selecione a escala de cores.
- Use as ferramentas de ROI para especificar uma região de interesse (ROI) em uma imagem óptica e medir a intensidade do sinal dentro do ROI. Se necessário, exporte os dados do sinal quantificado para o software de planilha e plote os dados.
- Para estudos de acompanhamento, analise necropsias de camundongos de vários tecidos (por exemplo, fígado, pulmão, coração, rim, baço, cérebro, etc.) lado a lado para uma distribuição não específica detalhada de anticorpos marcados com fluorescência.
nota: Os dados podem ser ainda mais apoiados com ELISA específico do tecido, fazendo uso de antígeno (FOLR1 neste caso) em 96 ensaios de poço.
