Coloração por citometria de fluxo de subpopulações de macrófagos infectados por Mycobacterium tuberculosis

Resumo

Fonte: Mily, A., et al. Polarização de células derivadas de monócitos humanos M1 e M2 e análise com citometria de fluxo na infecção por Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo mostra uma estratégia de controle de citometria de fluxo utilizando um painel multicolorido para analisar a viabilidade celular e marcadores específicos de anticorpos anti-humanos conjugados com fluorescência. Essa abordagem torna possível determinar com precisão a porcentagem de populações de células infectadas por Mycobacterium tuberculosis.

Protocolo

1. Coloração por citometria de fluxo de células derivadas de monócitos infectadas por Mtb

NOTA: As etapas a seguir devem ser executadas em uma instalação BSL-3. A coloração por citometria de fluxo pode ser realizada em uma placa de 96 poços em vez de tubos.

1. Separar as células infectadas por Mycobacterium tuberculosis, Mtb (e controlos não infetados) dos alvéolos na(s) placa(s) de 6 poços por incubação com 1 ml de tampão FACS por alvéolo durante pelo menos 30 min a 37 °C e 5% de CO₂.
2. Pipete suavemente para cima e para baixo algumas vezes para garantir que as células sejam destacadas. Se possível, confirme o descolamento da célula com microscopia. Transfira a suspensão de células de cada poço para um tubo de microcentrífuga com tampa de rosca e gire os tubos a 200 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante cuidadosamente pipetando.
3. Lave o pellet celular em cada tubo duas vezes com tampão FACS e gire as células a 200 x g por 5 min.
4. Corar as células (cerca de 0,5 x 10⁶ a 1 x 10⁶ células/tubo) com aproximadamente 50 μL de coquetel de anticorpos anti-humanos conjugados com fluorocromo, incluindo TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabela 1) em combinação com o corante de viabilidade Zombie-UV por 30 min a 4 ° C (geladeira) no escuro.
5. Lave as células coradas duas vezes com 400 μL de tampão FACS e gire as células a 200 x g por 5 min.
6. Fixe as células coradas com 200 μL de tampão de fixação (recém-preparado) por 30 min em RT no escuro para garantir a inativação completa das micobactérias.
7. Lave as células duas vezes com 400 μL de tampão FACS e gire a 200 x g por 5 min para remover o excesso de tampão fixo.
8. Ressuspenda as células fixas em 400 μL de tampão FACS e transfira as amostras para novos tubos de microcentrífuga de 1 mL antes de retirá-las do laboratório BSL-3 para citometria de fluxo em BSL-2. Armazenar as células coradas a +4 °C até à aquisição da amostra.
   nota: Pulverize os tubos com etanol a 70% antes de retirá-los do laboratório BSL-3. O formaldeído é tóxico (cancerígeno) e deve ser manuseado em um gabinete de biossegurança classe II. Descarte os resíduos de formaldeído em um resíduo químico separado.

2. Aquisição e análise de dados de citometria de fluxo de células derivadas de monócitos infectados por Mtb

NOTA: As etapas 2.1–2.2 devem ser executadas antes da coloração por citometria de fluxo descrita acima. Para evitar problemas com aglomeração celular e dissociação de corantes em tandem após a fixação celular, a aquisição de amostras de células infectadas e não infectadas por Mtb é realizada dentro de 4 a 10 horas após a coloração primária de anticorpos.

1. Antes da coloração por citometria de fluxo descrita acima, compense o sinal fluorescente para cada anticorpo conjugado com fluorocromo listado no painel de coloração (Tabela 1) usando contas de compensação (positivas e negativas).
2. Titular a diluição do anticorpo para coloração de macrófagos humanos para obter o sinal ideal para cada fluorocromo.
3. Use células não coradas para determinar o nível de fluorescência de fundo necessário para definir uma porta para a população de células negativas, permitindo que as células coradas sejam visualizadas (os macrófagos são altamente autofluorescentes).
4. Adquira um mínimo de 50.000 células/amostra no citômetro de fluxo usando o software recomendado para aquisição de dados.
5. Exportar os ficheiros de aquisição do citómetro de fluxo no formato padrão de citometria de fluxo (FCS) 3.1.
6. Analise os arquivos FCS no software de análise de citometria de fluxo.
7. Bloqueie macrófagos de acordo com suas características de dispersão direta e lateral (FSC e SSC) e exclua células mortas por gating de células vivas/mortas usando o corante de viabilidade Zombie-UV.
8. Visualize macrófagos infectados com H37Rv-GFP no canal FITC.
9. Identifique a frequência de células coradas positivamente e a intensidade média geométrica de fluorescência (MFI) para todos os marcadores (Tabela 1).

Tabela 1: Lista de anticorpos usados para citometria de fluxo.

laser	filtro	Fluorochrome	fenótipo	função	clone	Nº de catálogo.	companhia
639	670/30	AF647	TLR2	Receptor de reconhecimento de patógenos	TL2.1	309714	BioLegend
639	780/60	APC-Cy7	CD206	Receptor de manose	15-2	Rolamento 321120	BioLegend
405	Nº 610/20	BV605	CD163	Receptor depurador	GHI/61	333616	BioLegend
405	670/30	BV650	CD80	Molécula co-estimulatória	2D10	305227	BioLegend
405	710/50	BV711	CCR7	Receptor de quimiocina	G043H7	353228	BioLegend
405	780/60	BV785	CD86	Molécula co-estimulatória	IT2.2	305442	BioLegend
488	530/30	GFP	Mtb	Bactérias intracelulares
561	Rolamento 586/15	Pe	CD200R	Receptor inibitório	OX-108	329306	BioLegend
561	Nº 620/14	PE/DAZZLE 594	CD64	Receptor gama Fc I de IgG	10.1	305032	BioLegend
561	Nº 661/20	PE-Cy5 (PC5)	HLA-DR	Molécula de MHC classe II	L243	307608	BioLegend
355	450/50	BUV395	Corante de Viabilidade	Marcador de células vivas/mortas	Zumbi UV	423108	Invitrogen

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Formaldeído	Sigma-Aldrich	Rolamento F8775
Anticorpo secundário IgG Alexa Fluor 594 de cabra anti-camundongo	Invitrogen	R37121	Anticorpo secundário para CD64
Anticorpo secundário IgG Alexa Fluor 594 anti-coelho de cabra		A-11037	Anticorpo secundário para CD163
Soro fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
EDTA (0,5 M)	Hospital Universitário Karolinska, Huddinge	N/A
Conta BD Comp plus	Bd	560497