Um ensaio in vitro para estudar a capacidade citotóxica de células assassinas induzidas por citocinas

Resumo

Fonte: Hsiao, C. H., et al. Isolamento e expansão de células T assassinas induzidas por citocinas citotóxicas para tratamento do câncer. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para medir a capacidade citotóxica das células assassinas induzidas por citocinas (CIK) contra células cancerígenas. Após a co-cultura de células-alvo cancerígenas com células CIK, as células cancerígenas mortas são identificadas usando um corante de viabilidade fluorescente e são quantificadas usando citometria de fluxo, estimando o efeito citotóxico das células CIK.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Preparação de materiais

1. Armazene reagentes, anticorpos e produtos químicos conforme mostrado na Ficha de Dados de Segurança do Material (MSDS). Dissolver os fármacos ou citocinas em solventes como soluções-mãe e, em seguida, alíquota para armazenamento a -20 °C ou -80 °C.
   nota: Informações detalhadas para a preparação do material estão anotadas na Tabela de Materiais.

2. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)

1. Aquecer a solução de gradiente de densidade (Tabela de Materiais) a 18–20 °C antes de utilizar. Inverta o frasco de solução várias vezes para garantir uma mistura completa.
2. Colete 3 a 5 mL de amostra de sangue venoso humano em um frasco heparinizado e misture bem invertendo suavemente o tubo várias vezes.
3. Prepare 4 mL de solução de gradiente de densidade em um tubo estéril de 15 mL.
4. Coloque cuidadosamente 1 mL da amostra de sangue na solução de gradiente de densidade.
5. Centrifugue a 400 x g por 30 min a 18−20 °C (desligue o intervalo).
6. Aspire cuidadosa e imediatamente a camada de revestimento leucocitário de células mononucleares (cerca de 1 mL) de uma só vez para evitar perturbar as camadas para um tubo estéril de 15 mL usando uma pipeta estéril de 1 mL.
7. Adicione pelo menos 3 volumes (~ 3 mL) de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ao revestimento leucocitário no tubo de centrífuga. Suspenda as células pipetando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril.
8. Centrifugue a 400 x g por 10 min a 18−20 °C. Aspire o sobrenadante.
9. Suspender o sedimento celular com 5 ml de meio basal (Tabela de Materiais) e transferir para um balão. Cultivar as células numa incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO₂.

3. Indução e expansão CIK

1. No dia 0, cultive os PBMCs (1 x 10⁶) em meio basal fresco contendo 1.000 UI / mL de IFN-γ por 24 h em uma incubadora de cultura de células umidificada a 37 ° C e 5% de CO₂.
2. No Dia 1, atualize o meio com meio basal fresco contendo 50 ng/mL de anticorpo anti-CD3, 1 ng/mL de IL-1α humana recombinante (rh) e 1.000 U/mL de IL-2 rh. Atualize o meio a cada 3 dias.
3. No dia 7, atualize o meio com meio basal fresco contendo 1.000 U / mL de IL-2 rh. Atualize o meio a cada 3 dias até o final da expansão celular (Dia 14).

4. Imunofenotipagem para avaliação de células CIK

1. Lave as células CIK com 10 mL de PBS estéril. Centrifugue por 10 min a 300 x g e 18−20 ° C, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células com 10 mL de PBS. Conte o número de células e teste a viabilidade celular usando o ensaio de exclusão de azul de tripano.
2. Alicote as células CIK em seis tubos estéreis de 1,5 mL a uma densidade de ~ 5–10 x 10⁵ células/mL PBS. Rotular e tratar da seguinte forma: Tubo 1, Branco (sem anticorpos); Tubo 2, adicionar 20 μL do isotipo IgG1-FITC; Tubo 3, adicionar 20 μL de mAbs do isotipo IgG1-APC; Tubo 4, adicionar 20 μL de CD3-FITC; Tubo 5, adicione 20 μL de CD56-APC mAbs; e Tubo 6, adicionar 20 μL de CD3-FITC e 20 μL de CD56-APC mAbs.
3. Misture suavemente as células CIK com os anticorpos, pipetando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL e, em seguida, incube por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro.
4. Centrifugue os tubos por 10 min a 300 x g e 18−20 ° C. Aspire o sobrenadante e suspenda o pellet celular uma vez com 1 mL de PBS. Pipete-os suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL.
5. Repita a etapa 4.4.
6. Deixe os tubos no escuro antes da análise por citometria de fluxo.

5. Reconhecimento de marcador de CD

1. Transfira a suspensão celular para um tubo inferior redondo de poliestireno estéril de 5 mL com uma tampa de filtro de célula (malha de 100 μm) pipetando suavemente através da tampa. Coloque os tubos no carrossel em ordem.
2. Abra o software de análise de citometria de fluxo e crie uma pasta experimental. Clique no botão Novo Espécime para adicionar um espécime e um tubo ao experimento e nomeie os tubos da seguinte forma: Tubo 1, Em branco; Tubo 2, isotipo IgG1-CD3; Tubo 3, isotipo IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
3. Crie um sistema de bloqueio de dispersão para as populações de células CIK (Figura 1A).
   1. Selecione Tubo 1 (em branco) e clique no botão Dot Plot para criar um gráfico FSC-A/SSC-A. Desenhe uma porta retangular sobre toda a população de células com um limite FSC-A >5 x 10⁴ para excluir detritos celulares.
   2. Selecione o parâmetro SSC-A/SSC-H para o novo gráfico de pontos e desenhe uma porta de polígono ao redor de todas as células individuais. Selecione o parâmetro Contagem/FITC (CD3) e Contagem/APC (CD56) para o novo gráfico de histograma, respectivamente. Selecione o parâmetro FITC (CD3)/APC (CD56) para o novo gráfico de pontos e desenhe uma porta de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.
   3. Registre os dados de 20.000 células individuais em cada amostra. Clique no botão Carregar Exemplo para analisar primeiro o exemplo de controle em branco. Identifique toda a população de células CIK usando os parâmetros dos canais CD56 e CD3.
4. Repita a etapa 5.3 para a investigação de todas as amostras.
5. Abra os arquivos que contêm os valores estatísticos da amostra individual para analisar as populações de células CIK e reimprima-os em arquivos de análise.

6. Cultura e coloração de células K562 de leucemia mieloide crônica humana e células OC-3 de câncer de ovário

1. Células K562
   1. Cultive células K562 em meio completo (meio basal RPMI contendo 10% de soro fetal bovino [FBS] e 50 U/mL de antibióticos e ajuste a glicose para 4,5 g/L) a uma densidade de 0,5−1 x 106 células/mL em um frasco de cultura de células e incube em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Transfira os meios de cultura contendo as células K562 para tubos estéreis de 50 mL e coloque as células em pellet a 300 x g por 10 min a 18−20 ° C no dia do experimento.
   3. Aspire o sobrenadante, ressuspenda as células em 5 mL de PBS estéril e misture bem suavemente.
   4. Pulverize as células a 300 x g por 10 min. Aspire o sobrenadante, ressuspenda as células em PBS e ajuste as células K562 a uma concentração de 0,5-1 x 10⁶ células / mL.
   5. Adicione 0,5 μL de corante éster succinimidílico carboxifluoresceína (CFSE) a 1 mL de suspensão de células K562 em um tubo estéril de 15 mL a uma concentração final de 5 μM. Misture suavemente a suspensão pipetando para cima e para baixo pelo menos 3x.
   6. Deixe o tubo em uma incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO₂ por 10 a 15 min.
   7. Adicione 9 mL de PBS ao tubo e coloque as células em pellets a 300 x g por 10 min. Decante o sobrenadante e, em seguida, suspenda o pellet celular em 10 mL de meio completo. Transferir a suspensão celular para um balão de cultura de células e colocá-la na incubadora.
2. Células OC-3
   1. Cultura de células OC-3 em meio completo (meio DMEM/F12 contendo 10% de FBS e 50 U/ml de antibióticos) a uma densidade de 0,5–1 x 10,6 células num frasco de cultura de células a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Aspirar os meios de cultura e lavar as células com PBS 1 dia antes da experiência.
   3. Separe as células adicionando 1 mL de solução enzimática de dissociação celular (Tabela de Materiais) e incube por 5 min a 37 ° C.
   4. Suspenda as células adicionando 5 mL de PBS e misture bem delicadamente. Pulverize as células a 300 x g por 10 min e aspire o sobrenadante. Ressuspenda as células em PBS e ajuste as células para uma concentração de 0,5–1 x 10⁶ células/mL.
   5. Adicione 0,5 μL de corante CFSE a 1 mL da suspensão de células OC-3 em um tubo estéril de 15 mL a uma concentração final de 5 μM. Misture suavemente a suspensão pipetando para cima e para baixo pelo menos 3x.
   6. Deixe o tubo em uma incubadora de cultura de células a 37 ° C e 5% de CO₂ por 10 a 15 min.
   7. Adicione 9 mL de PBS ao tubo e pulverize as células a 300 x g por 10 min. Transvase o sobrenadante e, em seguida, suspenda o pellet celular com meio completo. Semeie 5 x 10⁵ células/poço em uma placa de 6 poços e incube em uma incubadora umidificada a 37 ° C e 5% de CO₂ durante a noite.

7. Ensaio citotóxico

1. Cocultura de células CIK e K562 (CIK-K562)
   1. Conte as células K562 da etapa 6.1.7 e teste a viabilidade celular pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. Adicione 1 mL de células K562 a cada poço em uma placa de 6 poços a uma densidade de 5 x 10⁵ / mL.
   2. Adicione 1 mL de meio basal com ou sem células CIK da etapa 3.4 à placa de 6 poços da etapa 7.1.1 da seguinte forma: Poço 1 = Branco, células K562 sozinhas (5 x 10⁵); Poço 2 = células K562 coradas com CFSE sozinhas (5 x 10⁵); Poço 3 = células CIK (E [efetor], 25 x 10⁵) + células K562 coradas com CFSE (T [alvo], 5 x 10⁵); Poço 4 = células CIK (E, 50 x 10⁵) + células K562 coradas com CFSE (T, 5 x 10⁵).
   3. Misture as suspensões celulares pipetando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x. Coloque a placa na incubadora por 24 h.
2. Cocultura de células CIK e OC-3 (CIK-OC-3)
   1. Adicione 1 mL de meio basal com ou sem células CIK da etapa 3.4 à placa de 6 poços da etapa 6.2.7 da seguinte forma: Poço 1 = Em branco, células OC-3 sozinhas (5 x 105); Poço 2 = células OC-3 coradas com CFSE isoladamente (5 x 10⁵); Poço 3 = células CIK (E, 25 x 10⁵) + células OC-3 coradas com CFSE (T, 5 x 10⁵); Poço 4 = células CIK (E, 50 x 10⁵) + células OC-3 coradas com CFSE (T, 5 x 10⁵).
   2. Misture as suspensões celulares pipetando-as suavemente para cima e para baixo pelo menos 3x. Coloque a placa na incubadora por 24 h.
3. Coloração do corante 7-aminoactinomicina D (7-AAD)
   1. Colha a suspensão de células CIK-K562 da etapa 7.1.3 diretamente em um tubo estéril de 15 mL.
   2. Colha as células em suspensão e aderentes dos grupos CIK-OC-3 da etapa 7.2.2.
      1. Transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 15 mL. Lave o poço com 1 mL de PBS estéril, colete o PBS e adicione ao tubo. Adicione 0,5 ml de solução enzimática de dissociação celular e incube durante 5 min a 37 °C.
      2. Adicione 1 mL da solução do mesmo tubo ao poço correspondente e misture suavemente as células pipetando-as para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL. Colete todas as células no mesmo tubo.
   3. Centrifugue a 300 x g por 10 min, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de PBS estéril. Pulverize as células a 300 x g por 10 min, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células em 100 μL de PBS estéril.
   4. Adicione 5 μL de corante 7-AAD (estoque de 50 ng/μL) à suspensão celular. Misture delicadamente as células pipetando-as para cima e para baixo pelo menos 3x com uma pipeta estéril de 1 mL. Incubar durante 10 min e deixar no escuro antes da análise.
4. Ensaio de capacidade citolítica
   1. Misture a suspensão celular da etapa 7.3.4 e repita as etapas 5.1 e 5.2 uma vez.
   2. Clique no botão Novo Espécime para adicionar um espécime e tubo ao experimento e nomeie os tubos da seguinte forma: Tubo 1, células K562 (ou OC-3) apenas; Tubo 2, apenas células K562 (ou OC-3) coradas com CFSE; Tubo 3, E:T = 5:1; Tubo 4, E:T = 10:1.
   3. Crie um sistema de gating de dispersão para o ensaio citolítico (Figura 2A).
      1. Selecione Tubo 1 e clique no botão Gráfico de pontos para criar um gráfico FSC-A/SSC-A. Desenhe uma porta retangular sobre todos os eventos com um limite FSC-A >5 x 10⁴ para excluir detritos celulares.
      2. Selecione o parâmetro SSC-A/CFSE para o novo gráfico de pontos. Selecione o parâmetro 7-AAD/CFSE para o novo gráfico de pontos e desenhe uma porta de quatro quadrantes para definir as quatro subpopulações.
      3. Clique no botão Carregar Amostra para analisar primeiro a amostra de controle em branco.
      4. Ajuste a tensão de SSC-A e FSC-A. Identifique a população de células mortas usando os parâmetros de canal CFSE e 7-AAD. Registre os dados de >20.000 células CFSE+ em cada amostra.
   4. Repetir o ponto 7.4.6 para a investigação de todas as amostras.
   5. Abra os arquivos que contêm os valores estatísticos de cada espécime individual para analisar as populações de células não viáveis e exportar os dados para arquivos de análise.

Resultados

Figura 1: A proporção de células T CD3 ⁺ CD56 ⁺ de uma amostra representativa de PBMC. (A) Os linfócitos foram reconhecidos por tamanho e granularidade específicos. População de células únicas selecionada para análise por citometria de fluxo. (B) A análise estatística da eficácia da expansão CIK de três doadores saudáveis foi realizada usando um teste t (*, p <...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
7-Amino Actinomicina D	Bd	559925
Anticorpo anti-CD56 humano de camundongo APC	Bd	555518	B159
APC Mouse IgG1, κ Controle de Isotipo	Bd	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II Citômetro de Fluxo	Bd	338962		SN: R33896202856
Diacetato de carboxifluoresceína éster succinimidílico (CFSE)	Bd	565082		Reconstritução do corante CFSE (500 mg) com 90 mL de DMSO
Solução de D-(+)-glicose	sigma	G8644		Para cultura de células K562. Adicione 12,5 mL a 500 mL de meio completo
Eagle Modificado Meio / F12 de Dulbecco	HyClone	SH30023.02		Meio basal para cultura de células OC-3
Soro fetal bovino	HyClone	SH30084.03		Para cultura de células K562 e OC-3. O meio completo contém 10% de FBS
Ficoll-Paque Plus	Ciências da Vida da GE Healthcare	71101700-EK		Solução de gradiente de densidade
Anticorpo CD3 anti-humano de camundongo FITC	Bd	555332	UCHT1
Mouse FITC IgG1, controle de isotipo κ	Bd	555748	MOPC-21
mAb anti-CD3 humano	Takara	T210	OKT3	Adicione 2,5 mL de estoque (1 mg / 1 mL) a 50 mL de meio de indução. Estoque de armazenamento a -80 °C
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122		Adicione 5 mL de estoque (10.000 U / mL) a 500 mL de meio completo. Armazenamento a 4 °C.
Proleucina	NOVARTIS			Reconstituição de Proleucina em Pó (22x106 UI) com 1,2 mL de água estéril e adicionar 2,7 mL a 50 mL de meio de indução. Estoque de armazenamento a -20 °C
Interferon-gama humano recombinante	CellGenix	1425-050		Reconstituição de rh IFN-g (5x105 UI/50 μg) com 200 μL de água estéril e adicionar 20 mL a 50 mL de meio de indução. Estoque de armazenamento a -20 °C
Interleucina-1 alfa humana recombinante	PEPROTECH	200-01A		Reconstituição rh IL-1α (10 μg) com 1 mL de água estéril e adicione 5 mL a 50 mL de meio de indução. Estoque de armazenamento a -20 °C
RPMI1640 médio	Gibco	11875-085		Meio basal para cultura de células K562. Estoque de armazenamento a 4 °C
Centrífuga Sigma 3-18K	sigma	10295
Enzima TrypLE Express	Gibco	12605028		Enzima de dissociação celular; Para desanexação de células aderentes. Armazenamento em temperatura ambiente
X-VIVO 15 médio	Lonza	04-418Q		Meio basal para células PBMC e CIK. Armazenamento a 4 °C