Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Preparação do reagente
- Prepare a solução estoque de meios de cultura para coleta de tecido total: 1 L de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 110 mL de soro fetal bovino (FBS), 11 mL de penicilina-estreptomicina (concentração final de 1%) e 1,1 mL de insulina esterilizada por filtro (concentração final de 0,1%). Armazenar a solução de stock a 4 °C.
- Prepare o tampão quelante # 1: 30 mL de meios de cultura (conforme descrito em 1.1), 600 μL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 0,5 M (concentração final 10 mM), 300 μL de gentamicina (concentração final de 1%) e 60 μL de anfotericina B (concentração final de 0,2%). Armazenar a solução de stock a 4 °C.
- Prepare o tampão quelante # 2: 30 mL de meio de cultura (conforme descrito em 1.1), 300 μL de EDTA 0.5 M (concentração final 5mM), 300 μL de gentamicina (concentração final de 1%) e 60 μL de anfotericina B (concentração final de 0.2%). Armazenar a solução de stock a 4 °C.
- Prepare o meio Minigut humano: 41,4 mL de DMEM/F-12, 5 mL de FBS (10% final), 500 μL de penicilina-estreptomicina (concentração final de 1%), 500 μL de L-glutamina (concentração final de 1%), 500 μL de gentamicina (concentração final de 1%), 100 μL de anfotericina B (concentração final de 0,2%), 500 μL de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico 1 M (HEPES) (concentração final 10 mM), 500 μL de suplemento 100x N-2 e 1 mL de suplemento 50x B-27 menos vitamina A para um volume total de 50 mL. Armazene a solução de estoque a -20 °C.
- Prepare o meio Minigut humano completo: 10 mL de meio Minigut humano (preparado em 1.4), 10 μL de 100 μg/mL Wnt3a (concentração final 100 ng/mL), 10 μL de 100 μg/mL Noggin (concentração final 100 ng/mL), 10 μL de 1 mg/mL R-Spondin (concentração final 1 μg/mL), 10 μL de 500 μg/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF) (concentração final de 50 ng/mL), 10 μL de N-acetilcisteína 1 M (concentração final de 1 mM), 10 μL de 10 mM Y-27632 (concentração final de 10 μM), 10 μL de 500 μM A-83 (concentração final de 500 nM), 10 μL de 10 mM SB202190 (concentração final de 10 μM), 100 μL de nicotinamida 1 M (concentração final de 10 mM) e 1 μL de 100 μM [leu] 15-gastrina 1 (concentração final de 10 nM). Volume total 10 mL. Armazenar solução de estoque a 4 °C.
nota: As soluções devem ser usadas dentro de 48 horas.
2. Isolamento de criptas e revestimento de tecido total
- No momento da coleta na sala de cirurgia, coloque a amostra de tecido do intestino delgado humano em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) fria. Lave a amostra em DPBS fria até que as fezes e o sangue estejam livres. Armazene a amostra a 4 °C em meio RPMI 1640 até que esteja pronto para isolamento da cripta.
nota: O tecido não pode ser armazenado por mais de 24 horas.
- Certifique-se de que a amostra esteja livre de fezes e sangue. Usando uma tesoura de dissecação delicada, remova qualquer excesso de gordura ou clipes/grampos cirúrgicos, etc. Pesar a amostra.
NOTA: Apontar para um pedaço de aproximadamente 0,75-2,5 g.
- Corte a amostra em pedaços de 0,5 cm e coloque em 30 mL de tampão quelante # 1 (conforme preparado na etapa 1.2).
- Agitar a velocidade baixa durante 15 min a 4 °C.
- Filtre o tecido através de um filtro de células de 100 μm e descarte o fluxo.
- Adicione o tecido a 30 mL de tampão quelante # 2 (conforme preparado na etapa 1.3).
- Agitar a velocidade baixa durante 15 min a 4 °C.
- Filtrar o tecido através de um filtro de células de 100 μm e eliminar o fluxo.
- Descongele 500 mL de matriz de membrana basal em gelo para uso na etapa 2.8.
- Adicione tecido a 10 mL de DMEM frio em um tubo cônico de 50 mL e agite vigorosamente com a mão por 10 s.
- Filtre através de um filtro de células de 100 μm e colete o fluxo (Rótulo # 1). Mantenha o tubo # 1 no gelo.
- Adicione tecido a outros 10 mL de DMEM frio em um tubo cônico separado de 50 mL e agite vigorosamente com a mão por 10 segundos.
- Filtre através de um filtro de células de 100 μm e colete o fluxo (rótulo # 2).
- Repita duas vezes adicionais até que haja quatro tubos cônicos com fluxo (tubos rotulados # 1-4).
- Solução do tubo de filtro #1 através de um filtro de célula de 100 μm e transfira o fluxo para um tubo cônico de 15 mL (Rótulo #1). Repita para # 2-4.
- Centrifugue os tubos de 15 mL #1-4 a 200 x g por 15 min a 4 °C.
- Na capela de fluxo laminar, remova o sobrenadante dos tubos # 1-4 e descarte. Evite interromper a nuvem de tecido imediatamente acima do pellet, mesmo que isso signifique deixar algum sobrenadante para trás.
- Pipetando lentamente, misture o pellet com o sobrenadante restante nos tubos # 1-4.
- Transfira a mistura dos tubos #1-4 para um único tubo cônico de 2 mL.
- Centrifugar o tubo cónico a 200 x g durante 20 min a 4 °C.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 μL da matriz da membrana basal.
nota: Mantenha a matriz da membrana basal no gelo o tempo todo e trabalhe rapidamente para as próximas etapas. Este produto polimeriza muito rapidamente à temperatura ambiente.
- Aplique 50 μL de suspensão de matriz de membrana de amostra/basal no centro de um poço em uma placa de 24 poços. Isso deve aparecer em forma de cúpula.
nota: O uso de ponteiras de pipeta resfriadas auxilia na transferência mais suave da suspensão, minimizando a polimerização.
- Repita 9 vezes para encher 10 poços no total.
- Coloque a placa de 24 poços em incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 30 min para permitir a polimerização.
- Adicione 500 μL de meio Minigut humano completo (conforme preparado na etapa 1.5) a cada poço. Substitua a cada 2 dias.
- Colete enteróides após 5-10 dias, quando a brotação é visualizada. Consulte as etapas 4 e 5 para obter instruções de coleta.
3. Indução de NEC Experimental
- Adicione 10 μL de 5 mg / mL de lipopolissacarídeo (LPS) a 500 μL de meio Miniintestinal Humano Completo (conforme preparado na etapa 1.5) em cada poço no Dia 0. Substitua a cada 2 dias até a coleta.
