Ensaio de adesão in vitro para detectar a adesão de células cancerígenas a armadilhas extracelulares de neutrófilos

Neste artigo

Resumo

Najmeh, S., et al. Isolamento e manuseio simplificado de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos (NETs). J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos um ensaio utilizando microscopia de fluorescência para detectar a adesão de células cancerígenas a armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs). Nos poços de teste, há um aumento notável no número de células cancerígenas marcadas com fluorescência que aderem aos TNEs, enquanto os poços tratados com DNase exibem adesão reduzida de células cancerígenas aos TNEs.

Protocolo

1. Ensaio de adesão estática de células cancerígenas TNE

Adicionar 100 μl do stock NET previamente obtido por alvéolo numa placa de fundo plano de 96 poços e deixar revestir os alvéolos O/N a 4 °C no escuro.
Entre 12 e 20 horas depois, verificar a formação de uma monocamada uniforme de NETs livres de células no fundo dos poços ao microscópio (Figura 1). Neste ponto, aspire suavemente todo o material não aderente para fora dos poços, certificando-se de não romper a monocamada NET na parte inferior.
Adicionar 100 μl de solução de bloqueio de albumina de soro bovino (BSA) a 1% em cada alvéolo e deixar repousar durante 1 h em RT.
Separe as células cancerígenas A549 de um frasco T-75 usando 2 ml de solução de tripsina a 0,25%. Uma vez destacado, adicionar 10 ml de meio A549 às células tripsinizadas e centrifugar a 450 x g a 4 °C durante 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em meio para obter uma concentração de 2 x10⁴células cancerígenas por 100 μl de meio.
nota: As células A549 foram cultivadas separadamente. Resumidamente, as células foram cultivadas e mantidas em meio DMEM F12 contendo 10% de FBS e 1% de Penicilina Estreptomicina e incubadas a 37 °C 5% de CO₂. Uma vez atingida a confluência celular de 70 a 80%, elas foram destacadas com tripsina-EDTA a 0,25% e ressuspensas no mesmo meio descrito acima.
Corar as células cancerígenas usando CFSE adicionando 1 μl de CFSE por ml de meio e deixando-o corar em RT por 10 min. Após a coloração, centrifugue a 450 x g a 4 ° C por 5 min e, em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda as células no volume inicial do meio para obter uma concentração de 2 x 10⁴ células cancerígenas por 100 μl de meio.
Após 1 hora de bloqueio de NETs, aspire suavemente a solução de bloqueio e adicione 2 x10⁴células cancerígenas no meio, o que equivale a 100 μl, por poço sobre a monocamada NET e deixe-a aderir por 90 min a 37 ° C 5% CO₂. Aspire suavemente as células e adicione 100 μl de PBS a cada poço para lavar as células não aderentes.
Em alguns poços, adicione 1000U de DNAse I por poço por 10 min antes de lavar para degradar os NETs. Isso servirá como um controle negativo. Em outros poços, adicionar 100 μl de água estéril por poço por 10 min, que servirá como controle veicular (VC).
NOTA: 3 réplicas por condição são geralmente realizadas para aumentar o tamanho da amostra.
Aspire e descarte todas as soluções nos poços, deixando apenas NETs e células cancerígenas aderentes no fundo. Adicione 100 μl de solução de formaldeído a 4% por poço para fixar as células cancerígenas aderentes ao NETS e leia o ensaio ao microscópio de fluorescência (Figura 1). Plotar e analisar os resultados (Figura 2).

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Resultados

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Figura 1. NET. Imagens de microscopia de luz dos poços de placa de 96 poços revestidos com NETs mostram (A) uma monocamada uniforme de NETs em todo o poço, em oposição a (B) revestimento inadequado do poço com uma camada interrompida de NETs. As barras de escala representam 40 μm.