Coloração de células bacterianas e preparação para estudos imunológicos

Resumo

Fonte: Yang, J. et al., Detecção automatizada e de alto rendimento de adesão bacteriana às células hospedeiras.J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a coloração e preparação de células bacterianas para estudos imunológicos usando corante fluorescente vermelho. As bactérias coradas são diluídas e ressuspensas em um meio de crescimento para atingir a concentração bacteriana desejada para a infecção da célula hospedeira, representando a multiplicidade de infecção.

Protocolo

1. Crescimento bacteriano e coloração

1. Execute todo o trabalho bacteriano em um Gabinete de Biossegurança, laboratório de Biossegurança Nível 2.
2. Inocular todas as culturas bacterianas, incluindo Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, etc., a partir do estoque de glicerol congelado e cultivá-las em caldo de soja tríptico (TSB, 3 mL) em uma incubadora agitável a 37 ° C durante a noite, mantida a 250 rpm.
3. No dia seguinte, use uma diluição de 1:100 da cultura noturna para inocular uma subcultura e cultive-a em TSB (1 mL) por 3 h até a fase exponencial, meça a densidade óptica, OD a 600 nm (OD₆₀₀) para confirmar. Certifique-se de que o OD₆₀₀ esteja na faixa de 0,4-0,6.
4. Antes de realizar o ensaio de aderência bactéria-hospedeiro, coloque diluições seriadas da suspensão bacteriana em placas de ágar TSB, incube-as durante a noite a 37 ° C e, em seguida, estabeleça as unidades formadoras de colônias bacterianas, UFCs do número de colônias. Para P. aeruginosa, um OD₆₀₀ de 1,0 corresponde a 2 x 10⁸ células bacterianas viáveis/mL, e para L. monocytogenes, um OD₆₀₀ de 1,0 corresponde a 9 x 10⁸ células bacterianas viáveis/mL.
5. Colha as culturas bacterianas na fase exponencial por centrifugação a 13.000 x g por 2 min em temperatura ambiente (RT) e, em seguida, lave-as uma vez usando 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS 1 mL). Ressuspenda os pellets bacterianos em 1 mL de 1x PBS e determine as concentrações medindo OD₆₀₀ de suspensões bacterianas. Por exemplo, P. aeruginosa com OD₆₀₀ de 0,5 representa uma concentração de 1 x 10⁸ células bacterianas/mL.
6. Manchar a suspensão bacteriana usando um corante fluorescente verde ou vermelho em RT por 30 min com rotação suave no escuro. Para isso, adicione 2 μL do corante de coloração concentrado de 500 vezes em 1 mL de suspensão bacteriana para diluir o corante em 1 vez. Para lavar o corante de coloração, centrifugue as bactérias coradas a 13.000 x g por 2 min e ressuspenda o pellet em 1 mL de 1x PBS três vezes.
   nota: Se bactérias marcadas com fluorescência (proteína fluorescente verde (GFP-), proteína fluorescente vermelha (RFP-), mCherry-, etc.) forem usadas no experimento, pule esta etapa de coloração bacteriana. P. aeruginosa marcada com GFP e L. monocytogenes corada com corante fluorescente vermelho foram usadas neste protocolo.
7. Colete as células bacterianas coradas ou bactérias marcadas com GFP por centrifugação a 13.000 x g por 2 min. Ressuspenda em meio F-12K fresco (1 mL) e meça o OD₆₀₀ de cada cultura. Diluir subsequentemente as culturas para as concentrações desejadas com base na multiplicidade de infecção (MOI) e na concentração da célula hospedeira. O volume final utilizado neste experimento é de 500 μL.
   nota: Por exemplo, se a concentração de células hospedeiras contada usando a coloração com Trypan Blue for 1 x 10⁵ células/mL, a concentração desejada de células bacterianas em um MOI de 100 será 1 x 10⁷ células/mL. A concentração de P. aeruginosa a 0,5 OD₆₀₀ é de 1 x 10⁸/mL. Para obter a concentração desejada, diluir a cultura de P. aeruginosa em 10 vezes e adicionar 50 μL de cultura ressuspensa a 450 μL de meio F-12K fresco.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10x PBS	VWR	Rolamento 45001-130
BactoView Live Red	Biotium	Rolamento 40101	Corante de bactérias
centrifuga	Eppendorf	5810R
E. coli			Estoque de laboratório
F-12k médio	ATCC	302004	Meio de cultura celular A549
Soro fetal bovino	Corning	35-016-CV
L. monocytogenes			Coleções do NIST
OD600 Dilufotômetro	IMPLEN
P. aeruginosa			Estoque de laboratório da Dra. Lori Burrows
P. aeruginosa ΔpilA			Estoque de laboratório da Dra. Lori Burrows
S. agalactiae			Coleções do NIST
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			Coleções do NIST
Caldo de soja típico	Células de crescimento	MBPE-4040