Detecção de ligação de vitronectina a superfícies bacterianas usando citometria de fluxo

Abstract

Fonte: Singh, B. et al., Ensaios para estudar o papel da vitronectina na adesão bacteriana e resistência sérica.J. Vis. Exp.(2018)

Este vídeo demonstra a detecção da interação da vitronectina com proteínas de superfície bacteriana. A análise por citometria de fluxo mede o sinal de fluorescência de anticorpos marcados com fluorescência ligados à vitronectina, confirmando sua presença na superfície bacteriana. Essa técnica fornece informações sobre as interações patógeno-hospedeiro e possíveis terapias de infecção bacteriana.

Protocol

1. Análise de Vitronectina, Vn como um ligante de proteína de superfície bacteriana

1. Detecção de ligação de Vn na superfície bacteriana usando citometria de fluxo
   nota: Na citometria de fluxo, usamos espalhamento lateral e espalhamento direto para eventos positivos. Para examinar as interações com Vn, Haemophilus influenzae tipo f, isolados clínicos Hif (n=10) foram selecionados juntamente com E. coli BL21 (DE3) como controle negativo (Figura 1A).
   1. Cultura de isolados clínicos Hif em meio de infusão cérebro-coração (BHI) suplementado com 10 μg/mL de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD) e hemina a 37 °C com agitação a 200 rpm. Use o meio Luria-Bertani para cultivar E. coli. Colha Hif na fase intermediária (densidade óptica, OD₆₀₀ = 0,3) e ressuspenda as bactérias em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2, contendo 1% (p / v) de albumina de soro bovino (BSA) (tampão de bloqueio; PBS-BSA). Ajustar a suspensão a 10⁹ unidades formadoras de colónias, UFC/ml.
   2. Transferir as alíquotas contendo 5 x 10⁶ UFC para 5 ml de tubos de poliestireno de fundo redondo (12 x 75 mm²) e adicionar 1 ml de tampão de bloqueio. Centrifugue a suspensão a 3.500 × g à temperatura ambiente (RT) por 5 min para repelir as bactérias e, em seguida, aspire cuidadosamente para remover o sobrenadante sem perturbar o pellet.
   3. Ressuspenda os pellets bacterianos com 50 μL de tampão de bloqueio contendo 250 nM Vn e incube as amostras por 1 h em RT sem agitação. Após a incubação, pulverize as bactérias por centrifugação a 3.500 x g por 5 min e, em seguida, lave os pellets três vezes usando PBS e etapas de centrifugação semelhantes.
   4. Ao pellet bacteriano, adicionar 50 μL de anticorpos policlonais primários de ovino anti-Vn humano (pAbs) na diluição de 1:100 em PBS-BSA. Incubar a suspensão durante 1 h à RT e, em seguida, lavar as bactérias três vezes com PBS para remover os anticorpos não ligados (conforme descrito no passo 1.1.3).
   5. Em seguida, adicione 50 μL de PBS-BSA contendo pAbs anti-ovinos conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (diluição 1:100) e incube em RT por 1 h no escuro.
   6. Prepare um controle em branco incubando bactérias apenas com tampão de bloqueio e pAbs sem Vn.
   7. Lave as bactérias três vezes com 1 ml de tampão de bloqueio e aplique uma camada de centrifugação na suspensão, conforme descrito no ponto 1.1.2. Finalmente, ressuspenda o pellet bacteriano com 300 μL de PBS e analise-o por citometria de fluxo.

Results

Figura 1: Haemophilus influenzae sorotipo f se liga a Vn via PH expresso na superfície.(A) Resultados da citometria de fluxo mostrando a ligação de Vn às células de isolados clínicos de Hif. Cada isolado clínico (5 x 10⁶ UFC) foi incubado com 250 nM de Vn humano. O ligante ligado foi detectado usando pAbs anti-Vn de ovelhas e anticorpos secundário...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL	Falcão BD	Nº 60819-138	12 × estilo 75 mm
Albuminas de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Adequado para cultura de células
Citômetro de fluxo	BD Biociências	651154	Grau de análise celular para aplicações de pesquisa
Vitronectina (Vn) do plasma humano	Sigma-Aldrich	Rolamento V8379-50UG	Grau de cultura celular
Hospedeiro de E. coli (E. coli BL21)	Novagen	Nº 69450-3	Hospedeiro de expressão de proteína
Anticorpos anti-ovinos conjugados com FITC	AbD Serotec	STAR88F	Policlonal
Anticorpos anti-Vn humanos de ovelhas	AbD Serotec	AHP396	Policlonal