Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do antigénio para injecção subcutânea
- Realize todos os procedimentos nesta seção dentro de uma capela de exaustão química para evitar a inalação ou contato da pele com o pó de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra. Manuseie de acordo com suas políticas institucionais para o Adjuvante de Freund Completo (normalmente BSL-1). Isso inclui o uso de luvas resistentes a produtos químicos, óculos de segurança e roupas de trabalho de proteção (jaleco).
- Use uma boa técnica estéril para evitar a contaminação de reagentes que serão introduzidos em animais experimentais.
- Faça a suspensão de Mtb em PBS misturando 5 mg de pó liofilizado e morto pelo calor de M. tuberculosis H37Ra com 2,5 mL de PBS frio em um tubo de microcentrífuga de 5 mL. Vortex uma vez por 30 segundos e depois coloque no gelo.
- Para gerar uma suspensão fina do H37Ra em PBS, sonicar a suspensão no gelo por 5 min.
- Solte o corpo da unidade conversora e limpe a sonda com um cotonete embebido em álcool 70% (v/v).
- Ligue o sonicador, ajuste a configuração de potência para 4 girando o botão de controle de energia e mergulhe a ponta da sonda no pó micobacteriano contendo PBS. Certifique-se de que a ponta da sonda esteja imersa em pelo menos metade da profundidade da amostra e que a ponta da sonda não esteja tocando a parede do tubo da microcentrífuga.
- Sonicar a mistura no gelo por 30 segundos, fazer uma pausa de 30 segundos e repetir por um total de 5 minutos para dispersar totalmente o pó em uma suspensão uniforme sem aquecer o líquido.
- Adicione 2,5 mL de adjuvante incompleto de Freund à mistura e repita o processo de sonicação no gelo até que a emulsão forme uma consistência semelhante a pasta de dente.
- Defina a potência para 0 usando o botão de controle e desligue a unidade para encerrar a sonicação. Remova a ponta da suspensão e limpe a sonda com um cotonete embebido em álcool.
- Armazenar a emulsão de antigénio a 4 °C. A produção de lotes da emulsão ajudará a garantir a consistência entre as experiências. A emulsão pode ser armazenada a 4 °C por até 3 meses.
2. Injeção subcutânea
- Realize a injeção subcutânea uma semana antes da injeção intravítrea (designada como dia -7).
- Carregue uma seringa de 1 ml (sem agulha) com a emulsão micobacteriana. Devido à viscosidade e opacidade da emulsão, bolhas de ar difíceis de ver podem encher a seringa.
- Para evitar bolhas de ar na seringa, depois de carregar 0,2-0,3 mL de emulsão, inverta a seringa (ponta voltada para cima) e bata suavemente com a seringa repetidamente na borda de um balcão para trazer as bolhas à superfície.
- Expulse o ar da seringa e continue a encher a seringa. Inverta e bata intermitentemente até encher.
- Coloque uma agulha de 25 G na seringa e avance a emulsão para encher a agulha. Guarde a seringa no gelo até ser usada.
- Para realizar a injeção subcutânea com segurança, anestesie o camundongo ou utilize métodos de contenção humanos que permitam fácil acesso aos quartos traseiros do animal.
- Para anestesiar para injeção subcutânea, coloque o animal em uma câmara de indução de isoflurano (3%-4% para indução e 1%-3% para manutenção). Uma vez anestesiado, certifique-se de que o camundongo tenha uma frequência respiratória lenta e não apresente sinais de desconforto respiratório.
- Coloque as injeções subcutâneas na superfície dorsal dos quadris ou na superfície ventral das pernas proximal à região dos gânglios linfáticos inguinais.
- Insira cuidadosamente a agulha para evitar a injeção no músculo. Injete 0,05 mL da emulsão Mtb no espaço subcutâneo. Não remova a agulha imediatamente para permitir que a emulsão espessa seja totalmente injetada.
- Repita a injeção nos lados esquerdo e direito para um total de 0,1 mL por animal.
- Se anestesiado, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento quente até a recuperação completa. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
- Retorne o mouse à gaiola após a recuperação completa e rotule o cartão da gaiola com a data da injeção subcutânea.
- Forneça analgesia com paracetamol oral (200 mg/kg/dia), mas não AINEs, pois os agentes anti-inflamatórios podem afetar a indução da uveíte.
3. Preparação da reserva de antigénios para injecção intravítrea
- Execute todos os procedimentos nesta seção em condições estéreis apropriadas para evitar a contaminação da suspensão intravítrea de Mtb.
- Faça as suspensões intravítreas.
- Para indução de panuveíte leve a moderada, faça a suspensão intravítrea na concentração de 5 mg / mL adicionando 5 mg do extrato de micobactéria a 1 mL de 1x PBS.
- Para indução de panuveíte moderada a grave, faça a suspensão intravítrea na concentração de 10 mg/mL adicionando 10 mg do extrato de micobactérias a 1 mL de 1x PBS.
- Vortex uma vez por 30 segundos e depois coloque no gelo.
- Para gerar uma suspensão fina do H37Ra em PBS, sonicar a suspensão no gelo por 10 minutos, conforme descrito na etapa 1.4. Aliquotar esta solução de reserva em volumes de 100 μL e conservá-la a -20 °C.
- Antes de usar, descongele em temperatura ambiente e vórtice em alta por 1 min. Mantenha as alíquotas no gelo enquanto as transporta para o biotério.
4. Procedimento de injeção intravítrea no dia 0
- Preparação animal
- Use luvas de exame ajustadas e coloque o mouse em uma balança para obter seu peso em gramas.
- Administre uma injeção intraperitoneal de 0,02 mL / g de peso corporal de uma solução contendo 100 mg / mL de cetamina e 20 mg / mL de xilazina misturada com água estéril para anestesiar o animal. Uma abordagem alternativa inclui indução usando ~ 1.5% de isoflurano (inalado).
- Aguarde aproximadamente 2 minutos para que o mouse adormeça e, em seguida, coloque-o em uma caixa de aquecimento e cubra a tampa. Realize testes de reflexo da dor, como pinça de orelha, dedo do pé e cauda, para avaliar a profundidade da anestesia para o procedimento.
- Uma vez adormecido, anestesiar a córnea com 1 gota de tetracaína a 0,5% (v/v). Evite colocar tetracaína perto do nariz ou da boca do camundongo. Após 10 s, enxugue o excesso de líquido.
nota: Observou-se que a dilatação da íris e a visualização da câmara anterior (CA) melhoram quando a anestesia tópica é administrada, possivelmente devido à melhora da supressão do reflexo corneano com a anestesia sistêmica e tópica combinada. No entanto, esta etapa pode ser omitida, se desejado.
- Dilate a pupila com 1 gota de fenilefrina a 2,5% (v/v). Tenha cuidado para evitar gotículas em excesso que possam entrar no nariz ou na boca. Após 2-3 min, retire o excesso de líquido.
- Para diminuir o risco de endoftalmite, adicione 1 gota de betadina a 5% na superfície dos olhos e nos cabelos ao redor. Deixe no olho por 2-3 min.
nota: Execute todos os procedimentos desta seção sob condições estéreis apropriadas para evitar endoftalmite.
- Remova a betadina e cubra o olho com hipromelose (0,3%) ou gel ocular carbômero 0,2% p / p) para evitar o ressecamento sob anestesia. Isso também ajudará a prevenir a formação de catarata.
- Configurando o sistema de microinjeção
- Realize a injeção intravítrea usando uma microbomba conectada a um controlador de bomba de microsseringa e uma seringa de injeção (Figura 1A-C). Em alternativa, injetar com uma agulha de 33 G acoplada a uma seringa de Hamilton, conforme descrito na subsecção 4.4.
- Conecte uma agulha de 34 G ao suporte da injeção para montar o injetor. Afrouxe a tampa de rosca prateada na extremidade frontal do suporte de injeção e deslize a agulha para dentro do corpo do suporte até a metade. Aperte bem a tampa de rosca prateada com os dedos.
- Conecte a tubulação ao suporte de injeção conforme mencionado nas etapas 4.2.4-4.2.5.
- Para inserir a tubulação no suporte de injeção, solte o parafuso de plástico na extremidade traseira do suporte, deslize a tubulação pela junta interna e aperte o parafuso.
- Mantenha um pequeno espaço com a extremidade da tubulação para evitar danos à tubulação durante a injeção. Consulte a Figura 1C.
- Descongelar uma alíquota de 100 μL da suspensão de estoque de micobactérias.
- Adicione 3 μL de uma solução de fluoresceína sódica a 1% (AK-Fluor) e vortex bem.
- Carregue uma seringa de 10 μL com a mistura de antígeno e fluoresceína sem incluir bolhas de ar.
- Remova a agulha de carregamento da seringa e deslize o tubo através da junta da tampa de rosca prateada até que a ponta atinja a marca zero no corpo da seringa.
- Assim que a ponta do tubo estiver alinhada corretamente na posição desejada, aperte bem a tampa de rosca.
- Lave a solução na seringa através do tubo de injeção para carregar totalmente o sistema. Em seguida, repita os passos 4.2.8-4.2.11 para recarregar a seringa para injeção.
- Para instalar a seringa carregada na microbomba, pressione o clampbotão de liberação na extremidade da microbomba para abrir a seringa clamps.
- Posicione a tampa do êmbolo no suporte da tampa do êmbolo na extremidade traseira da microbomba.
- Em seguida, deslize o colar da seringa no batente do colar e o corpo da seringa no grampo da seringa.
- Solte o clamp botão e aperte o parafuso de retenção do êmbolo. Consulte a Figura 1D.
- Deslize o suporte de injeção e a agulha através do o-clamp no aparelho de injeção estereotáxica. Esta é uma plataforma personalizada; Alternativamente, a seringa pode ser segurada e posicionada manualmente.
- Defina o volume de infusão e a taxa de volume de infusão no controlador da bomba de microseringa para injetar 500 nL por ciclo a uma taxa de 40 nL/s, respectivamente.
nota: Taxas de injeção mais rápidas podem ser usadas, no entanto, mais refluxo pode ser experimentado antes que o reposicionamento da agulha possa ser alcançado.
- Teste o sistema para garantir o funcionamento correto antes de realizar uma injeção intravítrea.
nota: Quando o sistema de injeção estiver funcionando corretamente, a ativação de um ciclo de injeção usando o pedal ou a almofada de controle produzirá um movimento visível do suporte da tampa do êmbolo e uma pequena gota de líquido esverdeado será vista na ponta da agulha. No caso de nenhum líquido ser produzido, ative ciclos adicionais ou lave e recarregue a seringa.
- Antes de injetar o olho, limpe suavemente a agulha com uma almofada de etanol a 95%.
- Procedimento de injeção intravítrea
- O mouse é colocado em um aparelho estereotáxico para realizar o procedimento de injeção.
- Mantenha o palco/plataforma em que o mouse repousa aquecido prendendo 2-3 toalhas de papel em sua superfície.
- Coloque o mouse em uma posição de bruços na plataforma. Use as barras auriculares direita e esquerda para fixar suavemente a cabeça do animal. Consulte a Figura 1E.
- Posicione o mouse e oriente-o sob o escopo de forma que o aspecto nasal superior do olho direito fique visível.
- Use uma agulha de 30 G para deslocar os cílios e expor a esclera. Visualize o limbo e o vaso sanguíneo radial.
- Use uma agulha estéril de 30 G para fazer um orifício guia na esclera 1-2 mm posterior ao limbo.
- Insira a agulha de 34 G presa ao suporte de injeção no olho através do orifício guia em um ângulo que evite a lente, mas coloque a ponta da agulha na cavidade vítrea.
- Usando o controlador da bomba de microseringa, injete cuidadosamente 1 μL do extrato de Mtb na cavidade vítrea. Em caso de refluxo consistente, aumente o volume de injeção para 1,5 μL para garantir a administração adequada da dose.
nota: Para controles simulados, injete 1 μL de PBS no olho do animal.
- Verifique a colocação intravítrea pela visualização de um reflexo esverdeado no olho. Consulte a Figura 1F.
- Após 10 s, retire a agulha do olho. Observe qualquer refluxo.
- Remova o mouse da plataforma, coloque 0,3% de hipromelose ou 0,2% p / p de pomada ocular de carbômero em ambos os olhos para proteção da córnea e vá para a caixa de aquecimento de recuperação.
- Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não retorne à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Quando o camundongo estiver totalmente acordado, volte para a gaiola e adicione uma garrafa de água medicamentosa com paracetamol (200-300 mg / kg / dia). Rotule o cartão de gaiola com a data da injeção de IVT.
- As injeções intravítreas são geralmente bem toleradas. Os sinais clínicos que podem indicar dor e a necessidade de remoção do estudo incluem alopecia periocular (indicativa de autotrauma), ulceração da córnea, perda de peso e postura curvada.
- Método alternativo para injeção intravítrea
nota: Este procedimento é realizado usando um microscópio cirúrgico e uma agulha de 33 G em uma microsseringa.
- Proptose o olho e segure-o na posição com uma pinça.
- Em seguida, aplique gel de olho carbômero 0,2% p/p ou gel de olho de hipromelose 0,3% e coloque uma lamínula circular (7 mm de diâmetro) sobre o olho.
- Monte uma agulha hipodérmica de 33 G em uma seringa Hamilton de 5 μL e insira-a aproximadamente 2 mm circunferencial ao limbo da córnea com um ângulo de injeção de ~ 45 °.
- Guie o chanfro da agulha para o vítreo, parando entre a lente e o disco óptico (do ponto de vista relativo do cirurgião, isso está acima/cobrindo o disco óptico - aproximadamente 1,5 mm do local de inserção) e injete 2 μL de Mtb (a 2,5 ug/μL em PBS) lentamente.
- Segure a agulha no lugar brevemente (para reduzir a quantidade de refluxo do injetado) e remova-a.
- Após a injeção, reposicione o globo liberando a pinça. Uma gota de pomada de cloranfenicol a 1% p/p pode ser administrada ao olho neste momento para fornecer proteção adicional contra a endoftalmite pós-injeção.
- Após a injeção, vá para a caixa de aquecimento de recuperação conforme mencionado nas etapas 4.3.11-4.3.13.
5. Imagem OCT para detectar e quantificar uveíte
- Preparação animal
- Anestesiar o mouse conforme descrito nas etapas 4.1.2-4.1.4
- Dilate a pupila com 1 gota de fenilefrina a 2,5%. Tenha cuidado para evitar gotículas em excesso que possam entrar no nariz ou na boca. Após 2-3 minutos, retire o excesso de líquido.
- Coloque 0,3% de hipromelose ou 0,2% p / p de gel de carbômero no olho para evitar o ressecamento durante a anestesia. Isso também ajudará a prevenir a formação de catarata.
- Enrole o mouse em uma camada de gaze cirúrgica para manter o calor do corpo e coloque-o no do animal. Posicione a cabeça com a barra de mordida.
- Adquirir as imagens de OCT das câmaras anterior e posterior.
nota: Se obtiver imagens da câmara anterior e posterior, obtenha primeiro as imagens da câmara posterior (PC) para evitar a degradação da imagem após a formação de catarata. A formação de catarata pode ser evitada com lubrificação frequente e aplicação de 0,3% de hipromelose ou 0,2% p/p de gel ocular de carbômero. Para imagens estendidas (>10 min), manter o mouse aquecido (através do uso de uma almofada de aquecimento) também ajuda.
- Depois de ligar o sistema de imagem OCT, prenda a lente de imagem correta e ajuste a posição do braço de referência conforme necessário.
- Abra o software de imagem, crie o ID exclusivo do mouse e comece a criar imagens de acordo com o protocolo do fabricante da OCT.
- Usando a opção Free Run com o protocolo de varredura rápida, posicione o olho com o nervo óptico centralizado nas imagens da câmara posterior ou o ápice da córnea nas imagens da câmara anterior.
NOTA: A Tabela 1 contém parâmetros de protocolo de imagem para dois sistemas de imagem de pequenos animais disponíveis comercialmente. Consulte a Tabela de Materiais para obter as especificações do produto.
- Para imagens da câmara posterior, aproxime a OCT da superfície do olho. Tenha cuidado para evitar colocar a superfície da lente em contato com o olho.
- Assim que o olho estiver posicionado corretamente, pare a varredura rápida, selecione o protocolo de varredura de volume e ative a varredura com a opção Mirar.
- Para imagens do segmento posterior, ajuste até que o nervo óptico esteja centralizado na imagem de alinhamento horizontal do B-Scan e a retina esteja alinhada com o eixo de alinhamento vertical
- Para imagens do segmento anterior, ajuste a posição para centralizar o ápice da córnea na imagem de alinhamento horizontal do B-Scan e na imagem do alinhamento vertical do B-Scan. A presença de um artefato de reflexão em ambas as imagens confirmará o alinhamento adequado. Em seguida, desloque a imagem horizontal o suficiente para remover o artefato de reflexão. Consulte a Figura 2.
- Clique em Instantâneo para capturar a imagem de varredura de volume e, em seguida, clique em Salvar.
- Em seguida, obtenha a varredura média da linha central. Abra o protocolo de varredura e clique em Mirar seguido de Instantâneo. Clique com o botão direito do mouse no mesmo painel e clique em Média.
- Repita as etapas 5.2.1-5.2.9 para cada olho com ambas as lentes.
- Depois que todas as imagens forem coletadas, remova o mouse do e forneça proteção da córnea durante a recuperação, conforme listado nas etapas 4.3.11-4.3.13.
6. Pontuação de inflamação por OCT
- Pontue as imagens da OCT com a ajuda de avaliadores mascarados para a condição de tratamento.
nota: Para PMU no modelo de camundongo, recomenda-se o sistema de pontuação fornecido na Tabela 2.
- Se as imagens da câmara anterior (CA) e da câmara posterior (PC) foram obtidas, combine essas pontuações para obter a pontuação final para cada olho.
nota: A inflamação da câmara anterior se resolve antes da inflamação da câmara posterior.
Tabela 1: Parâmetros de varredura. (A) Parâmetros de varredura OCT. (B) Parâmetros de varredura de fundo de olho/OCT retiniano
| um | | | |
| Câmara Anterior de Camundongo | Varredura rápida | Varredura de volume | Varredura linear |
| Comprimento X Largura | 4,0 mm x 4,0 mm | 3,6 mm x 3,6 mm | 3,6 milímetros |
| ângulo | 0 | 90 | 90 |
| A-varredura / B-Varredura | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-varreduras | 50 | 400 | 1 |
| Quadros/B-scan | 1 | 3 | 20 |
| Câmara Posterior de Camundongo | Varredura rápida | Varredura de volume | Varredura linear |
| Comprimento X Largura | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 milímetros |
| ângulo | 0 | 0 | 0 |
| A-varredura / B-Varredura | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-varreduras | 50 | 200 | 1 |
| Quadros/B-scan | 1 | 3 | 20 |
| O | | | |
| Câmara Posterior de Camundongo | Varredura de volume | Varredura linear | |
| Comprimento X Largura | 0,9 mm x 0,9 mm | 1,8 milímetros | |
| ângulo | 0 | Qualquer (normalmente 0 ou 90) | |
| A-varredura / B-Varredura | 1024 | 1024 | |
| # B-varreduras | 512 | 1 | |
| Quadros/B-scan | 1 | 30 | |
Tabela 2: Critérios de pontuação da PMU OCT: As imagens da OCT são pontuadas de acordo com os critérios listados na tabela. As pontuações AC e PC são adicionadas para obter a pontuação final do olho. Nos casos em que não foi adquirida uma visão clara do olho, um escore de NA foi atribuído às imagens, e estas foram excluídas do estudo.
| OUT Descrições da pontuação |
| pontuação | Câmara Anterior | Câmara Posterior |
| NA | Sem visão além da córnea anterior | Sem visão do segmento posterior |
| 0 | Sem inflamação | Sem inflamação |
| 0.5 | 1–5 células no aquoso | Poucas células ocupando menos de 10% da área vítrea |
| OU edema da córnea | Sem infiltrados sub-retinianos ou intrarretinianos ou ruptura da arquitetura retiniana |
| 1 | 6 a 20 células no aquoso | As células difusas (sem aglomerados densos) ocupam entre 10 e 50% da área vítrea. |
| OU uma única camada de células na cápsula anterior do cristalino | Sem infiltrados sub-retinianos ou intrarretinianos ou ruptura da arquitetura retiniana |
| 2 | 20 a 100 células no sistema aquoso | Células difusas (sem aglomerados densos) ocupando > 50% da área vítrea |
| OU menos de 20 células e um hipópio presente | Sem infiltrados sub-retinianos ou intrarretinianos ou ruptura da arquitetura retiniana |
| 3 | 20 a 100 células no sistema aquoso | Células difusas iguais aos graus 2 e 1 |
| E um hipópio OU uma membrana pupilar | E pelo menos uma opacidade vítrea densa ocupando 10% a 20% da área vítrea OU a presença de células vítreas iguais a opacidades sub-retinianas ou intrarretinianas de grau 2 e raras (≤ 2) |
| 4 | Qualquer número de células aquosas | Opacidade vítrea densa ocupando > 20% da área vítrea. |
| E um grande hipópio e membrana pupilar OU perda da estrutura anterior devido à inflamação grave | OU células vítreas difusas com grandes opacidades sub-retinianas ou intrarretinianas |
