Avaliação da fosforilação de proteínas intracelulares induzida por citocinas estromais usando citometria de fluxo fosfométrica

Resumo

Fonte: Coats, J. S., et al. Expressão de citocina exógena em xenoenxertos derivados de pacientes por injeção com uma linha de células estromais transduzida por citocina. J. Vis. Exp. (123) (2017).

Este vídeo demonstra a avaliação da fosforilação intracelular de proteínas induzida por citocinas estromais em células leucêmicas. Essas proteínas fosforiladas intracelulares são quantificadas usando a técnica de citometria de fosfofluxo.

Protocolo

1. Ensaios de citometria de fosfofluxo para avaliar a atividade da citocina produzida pelo estroma

NOTA: Avalie o sobrenadante do estroma projetado antes do primeiro experimento para verificar a bioatividade relevante da citocina gerada pelo estroma para o experimento individual. Uma vez validado o estroma projetado, não são necessários mais testes, a menos que sejam introduzidos estromas produzidos com um novo vetor.

1. Adquira linhas celulares de leucemia MUTZ5 e/ou MHH-CALL4 (responsivas a TSLP), citocina humana recombinante e anticorpos aprovados para uso em ensaios de citometria de fosfofluxo para detectar alvos de fosforilação apropriados a jusante.
2. Descongele o sobrenadante colhido do estroma de controle e expressão de citocinas.
3. Coloque as linhagens celulares de leucemia em meio R20 (consulte a Tabela de Materiais) a uma concentração de 0,2 x 10⁶ células por poço em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Placa 3 poços por condição para permitir ensaios triplicados. Incubar durante 2 h a 37 °C. Esse tempo permite a perda de qualquer fosforilação ocorrida durante as condições de cultivo anteriores.
   NOTA: 12 poços por linha celular fornecem ensaios triplicados para cada condição experimental mostrada na etapa 1.4.
4. Após 2 h em cultura, transferir as células de cada alvéolo para tubos separados de 4 ml e centrifugar a 500 x g durante 5 min, a 4 °C. Transvasar o sobrenadante.
   1. Ressuspenda as células em 200 μL para cada uma das seguintes condições experimentais (realizar ensaios em triplicata): 1) meio de controle negativo apenas, 2) meio de controle positivo com citocina recombinante em concentração (s) de saturação (TSLP a 15 ng / mL, etc.), 3) sobrenadante do estroma de controle e 4) sobrenadante do estroma de citocina do estroma produtor de citocinas.
5. Incubar as células durante a duração especificada pelo fosfoensaio comercial específico (por exemplo, 30 min para fosfo-STAT5 em MUTZ5 ou MHH-CALL4 em resposta ao TSLP).
6. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C e decantar o sobrenadante.
7. Realize a coloração por citometria de fosfofluxo de acordo com o protocolo do fabricante e colete os dados da citometria de fluxo.
8. Analise os dados de citometria de fluxo.
   1. Porta em células intactas com base na dispersão de luz direta (FSC, indica o tamanho da célula) e lateral (SSC, indica granularidade da célula).
   2. Determinar a intensidade fluorescente mediana (IMF) das células intactas em cada amostra. Comparar a IFM média obtida a partir dos valores triplicados do sobrenadante das células estromais com a dos controlos dos meios positivos e negativos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipetas sorológicas de 10 mL	falcão	357551
Tubos cônicos de polipropileno de 15 mL	pescador	05-539-12
Tubos cônicos de polipropileno de 50 mL	falcão	352098
Ponteiras de pipeta de 1 mL	pescador	2707509
Ponteiras de pipeta de 200 μL	Denville Científico	P3020-CPS
Ponteiras de pipeta de 10 μL	Denville Científico	P-1096-CP
Meio de cultura celular "R20", % do volume total (perfaz 195 mL)			Receita de laboratório
RPMI, 76,84% (150 mL)	Tecnologia de mídia	10-040-CV
FBS, 20,49% (40 mL)	Tecnologia de mídia	35-011-CV
2mM L-glutamina, 1,02% (2 mL)	Tecnologia de mídia	35-011-CV
1 mM de piruvato de Na, 1,02% (2 mL)
Penicilina-estreptomicina, 0,51% (1 mL	Tecnologia de mídia	30-002-CL
2-Mercaptoetanol, 0,10% (0,1 M), 0,10% (200 μL)	parlamentar	190242
Biológicos
Linha celular "CALL-4" MHH-CALL-4, leucemia precursora de células B humanas	DSMZ	ACC 337
Linha celular MUTZ-5, leucemia precursora de células B humanas	DSMZ	ACC 490
Proteína TSLP humana recombinante	Sistemas de P&D	1398-TS-010
Anticorpos de citômero de fluxo (clone)*
Anti-mouse CD45 FITC (30F11)	Miltenyi Biotec	130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (o nome alternativo é IL-7Rα)	Miltenyi Biotec	130-098-094
CD34 APC (8G12)	BD Biociências	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	eBiociência	25-0459
Corante de viabilidade fixável "FVD" eFluor 780	eBiociência	Telefone: 65-0865
Cadeia leve Ig κ FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Cadeia leve Ig λ FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	BioLegend	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD Biociências	551079
pSTAT5 PE, rato anti-STAT5 (pY694)	BD PhosphoFlow	612567
Outros materiais e equipamentos
Software de análise de citometria de fluxo FlowJo	FlowJo, LLC	Versão 10
*Todos os anticorpos são anti-humanos, salvo indicação em contrário.