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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de tecido para fixação e inclusão de parafina
NOTA: As biópsias foram feitas de mulheres submetidas a cistoscopia com eletrofulguração de trigonite para o tratamento avançado da infecção recorrente do trato urinário (rUTI). rUTI é definida como 3 ITUs em 12 meses. A coleta de biópsia foi realizada na sala de cirurgia enquanto o paciente estava sob anestesia após obter o consentimento informado do paciente. Todas as amostras foram codificadas e desidentificadas antes da experimentação.
- Obtenha uma biópsia de copo frio (~ 1 mm3) do trígono da bexiga com pinça urológica via cistoscópio flexível e coloque imediatamente em um criovial estéril de 2 mL contendo 1,5 mL de paraformaldeído (PFA) a 4% v / v preparado em 1x solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS).
NOTA: 4% de PFA em 1x PBS pode ser feito com antecedência e armazenado a -20 °C até que seja necessário.
- Fixe a biópsia por 6 h em temperatura ambiente ou por 16-24 h a 4 ° C.
NOTA: A duração da fixação deve ser calculada com base no tamanho da amostra de tecido e a fixação excessiva deve ser evitada. Não é aconselhável usar glutaraldeído como fixador, pois introduz autofluorescência.
- Em um capuz esterilizado ou gabinete de biossegurança, remova o fixador por pipetagem e substitua-o por 1,5 mL de solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (PBS). Manter as amostras a 4 °C durante a noite ou efectuar imediatamente o processamento dos tecidos e a inclusão em parafina.
- Use um micrótomo esterilizado para seccionar blocos de tecido com 5 μm de espessura e cole seções de tecido de parafina em lâminas de microscópio de vidro carregadas. Um mínimo de duas lâminas por biópsia será necessário para o protocolo de hibridização in situ de fluorescência (FISH) de RNA ribossômico 16S (16S rRNA).
NOTA: O tecido da biópsia deve ser disposto transversalmente em relação ao plano de corte para garantir a visualização das camadas uroteliais em todas as seções. Deve-se notar também que a espessura da seção deve ser otimizada para detecção da comunidade bacteriana. Seções mais finas ou amostragem de várias seções seriadas podem ser necessárias no caso de infecções em que as bactérias residentes no tecido são extremamente escassas (por exemplo, <1 bactéria residente no tecido por 1,000 células de mamíferos).
2. Hibridização In Situ de Fluorescência com Sondas Universais 16S rRNA
NOTA: São necessárias duas lâminas por biópsia. Uma lâmina é necessária para a sonda universal 16S rRNA e uma lâmina para uma sonda de controle com uma sequência embaralhada. Isso é importante para distinguir o sinal verdadeiro do sinal de fundo durante a microscopia, uma vez que o epitélio da bexiga é autofluorescente em vários canais. Além da sonda de embaralhamento, o bloqueio com 0,1% de Sudan Black B antes da montagem pode reduzir a autofluorescência de fundo inerente ao tecido.
- Preparação de reagentes e capela de exaustão
- Limpe uma hotte vazia (ou cabine de biossegurança devidamente equipada) com etanol a 70%.
- Preparar o tampão de hibridização composto por cloreto de sódio (NaCl) 0,9 M, cloridrato de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl, pH 7,2) 20 mM, dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% em 10 ml de água filtrada estéril.
NOTA: A água filtrada estéril pode ser preparada passando água destilada autoclavada por um filtro de 0.22 μM. O tampão de hibridização pode ser armazenado em temperatura ambiente, mas o SDS pode precipitar da solução. Se a SDS precipitar, aqueça a solução em banho-maria a 50 °C antes de usar.
- Prepare pelo menos 100 mL de etanol a 95% e 90% em água filtrada estéril em garrafas lavadas e autoclavadas.
- Dissolva as sondas liofilizadas marcadas com fluorescência em Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) e tampão (TE) de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM preparado em água livre de nuclease esterilizada por filtro até uma concentração final de 100 μM. Prepare uma diluição de 1 μM em tampão TE para uso neste protocolo. Armazene as sondas concentradas de 100 μM e as sondas reconstituídas de 1 μM a -20 °C protegidas da luz.
NOTA: Não dissolva sondas marcadas com fluorescência em água. O tamponamento é necessário para evitar a hidrólise da ligação éster N-hidroxisuccinimida (NHS) que conjuga o fluoróforo com a sonda de nucleotídeos.
- Limpe cinco frascos de Coplin com etanol 70% (EtOH), deixe secar, rotule da seguinte forma: xilenos I, xilenos II, 95% EtOH, 90% EtOH, água bidestilada (ddH2O) e encha com 100 mL da solução apropriada. Isso ajudará a evitar confusão em etapas posteriores.
- Desparafinização e reidratação tecidual
- No capô, coloque duas lâminas por biópsia em um rack de lâminas vertical.
- Coloque um suporte deslizante vertical no frasco de xilenos I Coplin (contendo 100 mL de xilenos) por 10 min.
- Remova o rack deslizante dos xilenos I e seque o fundo em uma toalha de papel para remover o excesso de xilenos. Coloque no frasco de xilenos II Coplin por 10 min.
NOTA: Nunca trabalhe com xilenos fora de uma hotte certificada.
- Reidrate os cortes de tecido desparafinizado em lavagens sucessivas com etanol (95% e 90%) por 10 min cada nos frascos de Coplin rotulados respectivamente.
NOTA: Durante este stage, aqueça o tampão de hibridização a 50-56 °C em banho-maria.
- Remova o rack deslizante da lavagem com etanol a 90%, seque o fundo em toalhas de papel para remover o excesso de etanol e coloque no frasco ddH2O Coplin contendo 100 mL de ddH2O esterilizado por filtro por 10 min.
- Enquanto aguarda a lavagem ddH2O, dilua as sondas a 10 nM em um tampão de hibridização para criar a solução de coloração. Preparar 150 μL de solução de coloração por lâmina.
NOTA: Proteja a solução de coloração da luz envolvendo os tubos em papel alumínio e armazenando-os em uma gaveta. Ao trabalhar com sondas marcadas com fluorescência na bancada, considere desligar as luzes do teto quando possível. As sondas diluídas no tampão de hibridização não devem ser reutilizadas.
- Hibridização e contra-coloração
- Prepare uma câmara umidificadora para cada sonda colocando água Kimwipe encharcada e amassada e estéril no reservatório de uma caixa de ponteiras P1000. Coloque o cartucho do porta-pontas em cima - é aqui que os slides ficarão.
NOTA: É importante usar uma câmara umidificadora para evitar que as seções de biópsia sequem durante a hibridização. Deve-se notar que as câmaras umidificadoras disponíveis comercialmente são projetadas para manter uma atmosfera úmida e estável. No entanto, a técnica detalhada aqui controla suficientemente a umidade a um custo substancialmente menor.
- Remova as lâminas do suporte de lâminas e coloque-as sobre uma toalha de papel limpa (com o lenço voltado para cima). Use um Kimwipe para secar a lâmina. Tenha cuidado para apenas enxugar suavemente perto (não sobre) a seção de biópsia para absorver a água. Usando uma caneta hidrofóbica, desenhe uma borda ao redor da seção de biópsia e coloque o tecido da lâmina voltado para cima na câmara umidificadora.
NOTA: Trabalhe rapidamente para que os tecidos não sequem antes da hibridização.
- Coloque a câmara umidificadora em uma incubadora ajustada para 50 °C. Pipete 50-150 μL da solução de coloração diretamente sobre o tecido para que o retângulo feito pela borda hidrofóbica ao redor do tecido seja preenchido. Tenha cuidado para não adicionar muita solução para transbordar a borda hidrofóbica. Feche a caixa com cuidado.
- Incubar durante a noite (~16 h) a 50 °C no escuro. Se a incubadora tiver uma janela, cubra-a com papel alumínio para criar um ambiente escuro.
NOTA: Uma temperatura de hibridização abaixo da temperatura de fusão da sonda FISH é necessária para um sinal confiável. 50 °C é a temperatura ideal para a sonda universal 16S rRNA, mas pode não ser ideal para outras sondas.
- Na manhã seguinte, prepare pelo menos 500 mL de tampão de lavagem composto por cloreto de sódio (NaCl) 0,9 M e Tris-HCl 20 mM (pH 7,2) em ddH2O e esterilize com filtro em um frasco estéril com um filtro de tampa de frasco a vácuo. Aquecer a 50-56 °C em banho-maria.
- Remova as lâminas das câmaras de umidificação e remova cuidadosamente qualquer solução de hibridização restante com um Kimwipe. Coloque as lâminas em uma grade de coloração vertical.
- Coloque o rack de coloração em um frasco Coplin opaco contendo 100 mL de tampão de lavagem pré-aquecido por 10 min. Se os frascos de Coplin não forem opacos (por exemplo, vidro), coloque-os no escuro durante as etapas de incubação - talvez embaixo de uma caixa ou em uma gaveta.
- Repita a etapa de lavagem duas vezes com tampão de lavagem fresco em novos frascos Coplin.
- Durante as etapas de lavagem, prepare a contra-coloração diluindo uma solução estoque de 100 μg / mL de Hoechst 33342 1:1.000 no tampão de lavagem. No mesmo tubo, adicione a aglutinina de gérmen de trigo Alexa-555 (WGA) a uma concentração final de 5μg/mL e a faloidina Alexa-555 a uma concentração final de 33 nM. Armazene no escuro até a hora de usar.
NOTA: Hoechst, Alexa-555 WGA e Alexa-555 Faloidina marcam ácido desoxirribonucléico (DNA), mucina/uroplacinas e actina, respectivamente, e podem ser armazenados a longo prazo no escuro de acordo com as instruções do fabricante. As etiquetas fluorescentes usadas para sondas e contracolorações podem ser personalizadas para os conjuntos de filtros disponíveis para o microscópio a ser usado.
- Remova as lâminas da última lavagem e remova suavemente o excesso de tampão de lavagem com um Kimwipe. Coloque as lâminas com o lado do tecido voltado para cima em uma toalha de papel e adicione 50-150 μL de contra-coloração diretamente em cima do tecido para que a borda hidrofóbica seja preenchida, mas não transborde. Cubra até quatro lâminas com uma tampa de caixa criogênica e incube por 10 min em temperatura ambiente.
- Coloque as laterais de volta no suporte de coloração e lave mais duas vezes em potes Coplin com tampão de lavagem fresco, por 10 min cada.
- Seque bem as lâminas após a última lavagem e coloque o lenço de papel voltado para cima sobre uma toalha de papel sob uma caixa criogênica. Aperte uma gota de mídia de montagem diretamente em cima do tecido. Coloque delicadamente uma lamínula de tamanho apropriado (dependerá do tamanho da biópsia) por cima. Pressione suavemente as bolhas, pois elas interferem na imagem e permitem que as lâminas com lamínulas curem durante a noite no escuro.
- No dia seguinte, sele as bordas da lamínula na lâmina com uma leve camada de esmalte transparente. Deixar secar durante 10 minutos no escuro e depois conservar no escuro a 4 °C para microscopia confocal.
3. Visualização de 16S rRNA FISH por Microscopia Confocal
NOTA: Para este protocolo, os melhores resultados são alcançados com um microscópio confocal de varredura a laser com objetivas de 63x e 100x. São necessários conjuntos de filtros adequados para visualização da fluorescência Hoechst, Alexa-488 e Alexa-555. No entanto, a microscopia fluorescente padrão pode ser usada se um microscópio confocal não estiver disponível. Este protocolo é para um microscópio confocal de varredura a laser.
- Ligue o microscópio confocal e o software de computador associado ao microscópio de acordo com as instruções do fabricante.
- Carregue o slide e visualize com a objetiva 10x no canal azul (Hoechst). Foque com cuidado até que os núcleos estejam visíveis.
- Uma vez focado, altere a objetiva para alta ampliação (63x ou 100x). Adicione óleo por cima da lamínula. Refoque com a nova objetiva, certificando-se de que a lente objetiva entre em contato com o óleo durante o foco.
NOTA: Use apenas foco fino em alta ampliação (63x ou 100x). O óleo só deve ser usado para uma objetiva de óleo.
- Avalie rapidamente cada lâmina através da ocular no canal verde (proteína fluorescente verde aprimorada, eGFP/Alexa-488) para determinar quais lâminas são positivas para FISH e quais são negativas para FISH.
NOTA: É melhor que esta avaliação/pontuação inicial seja feita às cegas por um indivíduo separado para reduzir o viés experimental.
- Para obter imagens das biópsias coradas, comece com uma lâmina positiva de FISH e mude para o modo de visualização do computador. Selecione os canais 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) e 555 (Alexa-555). Defina o orifício usando o canal de comprimento de onda mais longo, neste caso 555. Encontre o plano focal correto para visualização de bactérias marcadas no canal 488. Sem alterar o plano focal, defina o ganho, a potência do laser e o deslocamento para cada canal, de modo que o sinal não fique saturado e o fundo não seja corrigido em excesso. Adquira a imagem nos três canais.
NOTA: Use as mesmas configurações para o canal 488 para criar imagens de todos os slides em um experimento. A potência do laser pode exigir ajuste nos canais 405 e 555 se o plano focal ideal para visualização bacteriana mudar entre os campos.