Uma técnica in vitro para geração mediada por irradiação UV de células T apoptóticas

Resumo

Fonte: Hodge, M. X., et al. Avaliação in vivo da eferocitose de macrófagos alveolares após exposição ao ozônio. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um método para induzir a apoptose nas células Jurkat - uma linha celular de leucemia de linfócitos T humanos. As células são expostas à radiação ultravioleta C (UVC), que causa extensos danos ao DNA e leva à morte celular apoptótica.

Protocolo

1. Preparação da linha de células Jurkat T (Dia 2)

NOTA: Todos os procedimentos devem ser realizados em uma cabine de segurança biológica classe II.

1. Cultura de células T Jurkat em 24 mL de meio de cultura de células basais + 10% de FBS + 5% de penicilina/estreptomicina a 37 °C + 5% de CO₂ (Tabela de Material). As células T Jurkat são uma linha celular em suspensão que pode ser mantida através da passagem 1:6-1:8 em meios de cultura pré-aquecidos a cada 3 dias. Não agite.
2. Para preparar células apoptóticas, cultive-as até 90% de confluência em cada frasco (o que leva de 3 a 4 dias para ser alcançado após a passagem). Para este estudo, utilizar células de cinco frascos T75 para obter um número suficiente de células utilizadas neste protocolo.
   nota: Um frasco confluente contém cerca de 20-24 milhões de células.
3. Pipetar as células (que é o balão inteiro) de cada balão (aproximadamente 24 ml) e transferir as células para um tubo cónico estéril de 50 ml, utilizando uma pipeta serológica. Use vários tubos cônicos para vários frascos.
4. Conte as células removendo uma alíquota de 11 μL de células do tubo cônico de 50 mL e misture com 11 μL de coloração azul de tripano e pipete 11 μL em lâminas de hemocitômetro.
5. Insira o slide em um contador de células automatizado e registre o número de células vivas para calcular a contagem total de células em cada frasco multiplicando o número de células vivas por 24, pois cada frasco contém 24 mL de meio.
6. Centrifugue a suspensão da célula a 271 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT) para granular as células.
7. Descarte o sobrenadante por aspiração e ressuspenda o pellet celular em meio para obter 3,0 x 10⁶ células por mL.
8. Alíquota de 5 mL de células em placas de cultura de tecidos de 100 mm x 20 mm (aproximadamente nove placas serão usadas; a quantidade total de células em cada placa deve ser ~ 15 x 10⁶).
9. Use um prato para controle/não exposto, e os pratos restantes serão expostos aos raios UV.
10. Defina o reticulador UV para o nível de energia correto, pressione o botão de energia e digite "600" usando o teclado numérico, que a máquina lerá como 600 μJ/cm² x 100.
    nota: As unidades de energia do reticulador UV estão em μJ/cm² x 100; portanto, para atingir 60 milijoules/cm², converta as unidades para corresponder ao reticulador UV.
11. Irradiar todos os pratos com células, não incluindo o controlo, a 60 milijoules (mJ)/^cm2 utilizando o reticulador UV. Remova a tampa superior das placas de cultura de tecidos durante a exposição aos raios UV, pois a luz UV não penetrará na tampa de plástico.
12. Incubar todas as placas numa incubadora de cultura de células, incluindo o controlo não exposto, a 37 °C a 5% de CO₂ durante 4 h.
13. Confirmar a apoptose por citometria de fluxo usando um kit de detecção de ensaio de apoptose contendo anexina V e iodeto de propídio (IP) (marcadores para apoptose e necrose, respectivamente) após 4 h de incubação, de acordo com as instruções do fabricante.
    nota: A irradiação de células T Jurkat no reticulador UV a um nível de energia de 600 μJ / cm², após uma incubação de 4 h, levará a ≥75% das células apoptóticas (precoces e tardias) com fenótipo apoptótico mais precoce do que o fenótipo apoptótico tardio. Isso torna mais fácil para os macrófagos alveolares reconhecê-los e envolvê-los, pois suas membranas não são comprometidas, ao contrário das células apoptóticas tardias, levando a um índice eferocítico mais alto e imagens mais precisas da eferocitose de macrófagos alveolares neste estudo.
    1. Agrupe 333 μL (1 x 10,⁶ células) de células T Jurkat de vários pratos ("sem UV" e "expostos aos raios UV") para usar em tubos de análise de compensação.
    2. Alíquota de 333 μL de células T Jurkat em uma coloração única de anexina V não corada, coloração única PI, sem controle de UV e 600 μJ/cm² tubos de citometria de fluxo marcados expostos a UV.
    3. Centrifugar os tubos a 188 x g durante 5 min à RT e decantar o sobrenadante.
    4. Lave as células ressuspendendo em 500 μL de solução salina fria 1x tamponada com fosfato (PBS).
    5. Centrifugar e granular as células a 188 x g durante 5 min à RT. Rejeitar o sobrenadante após centrifugação.
    6. Prepare 400 μL de 1x tampão de ligação por tubo de fluxo, diluindo 10x tampão de ligação com água destilada enquanto as células estão centrifugando.
    7. Preparar o reagente de incubação de anexina V e PI (100 μL por amostra/tubo) de acordo com as instruções do fabricante.
    8. Transvase o sobrenadante após centrifugação e ressuspenda suavemente todos os tubos em 400 μL de tampão de ligação 1x e, em seguida, adicione 100 μL de reagente de incubação de anexina V a cada tubo de amostra. Por fim, adicione 100 μL de coloração única de anexina V e coloração única PI aos seus respectivos tubos, mas não adicione nada além do tampão de ligação 1x ao tubo não corado.
    9. Incube os tubos no escuro por 15 min em RT.
    10. Centrifugue todas as células a 188 x g por 5 min em RT e decantar o sobrenadante.
    11. Ressuspenda as células em 400 μL de tampão de ligação 1x e, em seguida, analise as amostras quanto à apoptose por citometria de fluxo. Colete pelo menos 10.000 eventos por tubo para permitir uma representação precisa da coloração.
14. Combine todas as células irradiadas dos pratos em um tubo cônico de 50 mL e células de pellets por centrifugação a 271 x g por 5 min em RT.
15. Descarte o sobrenadante do tubo por aspiração e ressuspenda as células em 24 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) e células de pellets por centrifugação a 271 x g por 5 min à temperatura ambiente.
16. Descarte o sobrenadante do tubo por aspiração e ressuspenda as células na quantidade de PBS usada para dosar camundongos aprovados pela IACUC. A dose utilizada está entre 5-10 x 10⁶ células/50 μL por camundongo; portanto, para 10 camundongos, ressuspenda em 500 μL (o número de células em cada dose varia dependendo de quantas células são cultivadas para irradiação).
    nota: Faça pelo menos duas doses adicionais para compensar qualquer líquido que possa grudar nas laterais da ponta da pipeta, resultando na perda de células.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit Anexina V-FITC	Trevigen	4830-250-K	O Kit TACS Annexin V-FITC permite a identificação rápida, específica e quantitativa da apoptose em células individuais ao usar citometria de fluxo.
Células T BCL2 Jurkat	ATCC	ATCC CRL-2899	A linhagem celular BCL2 Jurkat foi derivada da transfecção de células T Jurkat humanas com o vetor de expressão pSFFV-neo mamífero contendo a inserção ORF BCL-2 humana e um gene resistente à neomicina. Tem sido para modelos de medição de eferocitose.
Contador de Células Automatizado Countess II	Thermofisher	AMQAX1000	É uma plataforma de ensaio de bancada equipada com óptica de última geração, foco automático completo e software de análise de imagem para avaliação rápida de células em suspensão. Muito fácil de usar.
Citocentrífuga Cytospin 4	Thermofisher	A78300003	Fornece preparações econômicas de camada fina a partir de qualquer matriz líquida, especialmente fluidos hipocelulares, como fluido de lavagem broncoalveolar.
Soro fetal bovino, qualificado, inativado por calor	Thermofisher	16140071	Fornece nutrientes às células cultivadas para que elas cresçam. É padrão para cultura de células.
Penicilina-estreptomicina	Sigma/Aldrich	Rolamento P0781-100ML	A penicilina-estreptomicina é a solução antibiótica mais comumente usada para cultura de células de mamíferos. Além disso, é usado para manter condições estéreis durante a cultura de células.
RPMI 1640 Médio, Suplemento GlutaMAX	Thermofisher	61870036	O meio RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) foi originalmente desenvolvido para cultivar células leucêmicas humanas em suspensão e como monocamada. Desde então, o meio RPMI 1640 foi considerado adequado para uma variedade de células de mamíferos, incluindo HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrócitos e carcinomas. Ajuda a cultivar células T Jurkat de forma rápida e eficiente.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker	Cambridge Científica	Rolamento 16659	O reticulador UV Stratalinker foi projetado para induzir apoptose, DNA ou RNA de reticulação em membranas de nylon, nitrocelulose ou nitrocelulose reforçada com nylon.