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Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação da amostra
- Coletar sangue periférico em tubos heparinizados de 9 mL e manter a amostra em temperatura ambiente (TR) em rotor até que seja necessária para o protocolo experimental.
- Rotule os tubos do citômetro de 5 mL para controles negativos (2 tubos), controles positivos (2 tubos) e diferentes concentrações de alérgeno/medicamento (1 tubo por cada concentração de alérgeno/medicamento testada). Coloque os tubos em um rack onde os tubos se encaixem perfeitamente sem escorregar.
- Prepare o tampão de estimulação em água bidestilada contendo 2% (v / v) de HEPES, 78 mg / L de NaCl, 3,7 mg / L de KCl, 7,8 mg / L de CaCl2, 3,3 mg / L de MgCl2, 1 g / L de HSA. Ajuste o pH para 7,4 e adicione IL-3 a 2 ng/mL. Normalmente, prepare 100 mL e divida em alíquotas de 2,5 mL para serem congeladas a -20 °C.
- Preparar controles positivos em PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Controle positivo 1, N-Formil metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (4 μM), para confirmar a qualidade dos basófilos; Controle positivo 2, Anti-IgE (0,05 mg/mL) como controle positivo mediado por IgE.
- Prepare o alérgeno/medicamento em PBS-T em 2x a concentração final desejada.
nota: As concentrações ótimas de alérgenos/medicamentos a serem utilizadas devem ser previamente determinadas usando uma ampla gama de concentrações, por curvas dose-resposta e por estudos de citotoxicidade seguindo as mesmas etapas do protocolo.
2. Preparação da mistura de coloração
- Adicione anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo ao tampão de estimulação seguindo a concentração de anticorpos recomendada pelo fabricante ou por titulação anterior de anticorpos. Neste protocolo, adicionamos 1 μL de cada anticorpo (CCR3-APC e CD203c-PE para identificação de basófilos; CD63-FITC para ativação de basófilos) por 20 μL de tampão de estimulação.
nota: Proteja a preparação da mistura de coloração da luz.
- Adicione 23 μL de mistura de coloração a cada tubo.
3. Estimulação sanguínea
- Adicione 100 μL de PBS-T aos tubos 1 e 2 (controle negativo), 100 μL de fMLP ao tubo 3, 100 μL de anti-IgE ao tubo 4 e 100 μL das diferentes concentrações de alérgenos/medicamentos aos seguintes tubos. Incubar durante 10 min a 37 °C num banho termostático com agitação média para pré-aquecer os reagentes.
- Adicione suavemente 100 μL de sangue a cada tubo para evitar hemólise. Agitar suavemente os tubos e incubar durante 25 min a 37 °C num banho termostático com agitação média.
- Pare a degranulação, mantendo os tubos a 4 °C por pelo menos 5 min.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui a 4 °C por 30-45 min, se necessário.
4. Lise de eritrócitos
- Adicione 2 mL de tampão de lise 1x a cada tubo para lisar eritrócitos. Vortex cada tubo e incubar por 5 min em RT.
nota: Nesta etapa, as células são fixadas devido a agentes fixadores (formaldeído) contidos no tampão.
- Centrifugue a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Transvasar o sobrenadante, virando a grelha para um lavatório. As células permanecem no fundo dos tubos.
- Adicione 3 mL de PBS-T a cada tubo para lavar as células. Vórtice cada tubo.
- Centrifugue a 300 x g a 4 °C por 5 min. Transvase o sobrenadante, transformando o rack em uma pia.
nota: Manter as amostras a 4 °C, protegidas da luz até à aquisição do citómetro de fluxo.
5. Aquisição por citometria de fluxo
- Adquira amostras por citômetro de fluxo (por exemplo, citômetro de fluxo BD FACSCalibur). Conecte o citômetro de fluxo ao software do computador e espere que o citômetro esteja pronto. Carregue as configurações do modelo e do instrumento (Tabela 1).
- Inicie a aquisição de amostras.
- Use as seguintes estratégias de citômetro para a seleção de basófilos ativados.
- Bloqueie os linfócitos do gráfico de dispersão lateral (SSC) - dispersão direta (FSC).
- Bloqueie os basófilos da população de linfócitos como células CCR3 + CD203c +. Adquira pelo menos 500 basófilos por tubo.
- Mostre um gráfico CCR3 - CD63 para analisar a ativação usando CD63 como marcador de ativação. Defina o limite negativo de CD63 para aproximadamente 2.5% usando os tubos de controle negativo.
- Adquira todas as amostras.
Tabela 1: Requisitos do citômetro de fluxo
| Fontes de luz (lasers) | Laser de íons de argônio refrigerado a ar Coherent SapphireTM de 488 nm; 20 mW; Laser refrigerado a ar JDS UniphaseTM HeNe de 633 nm; 17 mW |
| Comprimento de onda excitatório da luz | Laser azul: 488 nm; Laser vermelho: 633 nm |
| Potência da fonte de luz no comprimento de onda excitatório | Laser azul: 20 mW; Laser vermelho: 17 mW |
| Filtros ópticos | SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE: 585/42, APC: 660/20 |
| Detectores ópticos | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC |
| Detectores ópticos tye | Laser de íons de argônio refrigerado a ar |
| Caminhos ópticos | Octógono BD (linha de laser de 488 nm); BD Trigons (linha de laser de 633 nm) |