Analisando a ativação de basófilos na presença de um alérgeno de teste usando citometria de fluxo

Resumo

Fonte: Doña, I. et al., Teste de ativação de basófilos para diagnóstico de alergia. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, demonstramos o teste para avaliar a ativação de basófilos na presença de um alérgeno de teste usando citometria de fluxo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Preparação da amostra

1. Coletar sangue periférico em tubos heparinizados de 9 mL e manter a amostra em temperatura ambiente (TR) em rotor até que seja necessária para o protocolo experimental.
2. Rotule os tubos do citômetro de 5 mL para controles negativos (2 tubos), controles positivos (2 tubos) e diferentes concentrações de alérgeno/medicamento (1 tubo por cada concentração de alérgeno/medicamento testada). Coloque os tubos em um rack onde os tubos se encaixem perfeitamente sem escorregar.
3. Prepare o tampão de estimulação em água bidestilada contendo 2% (v / v) de HEPES, 78 mg / L de NaCl, 3,7 mg / L de KCl, 7,8 mg / L de CaCl₂, 3,3 mg / L de MgCl₂, 1 g / L de HSA. Ajuste o pH para 7,4 e adicione IL-3 a 2 ng/mL. Normalmente, prepare 100 mL e divida em alíquotas de 2,5 mL para serem congeladas a -20 °C.
4. Preparar controles positivos em PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): Controle positivo 1, N-Formil metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (4 μM), para confirmar a qualidade dos basófilos; Controle positivo 2, Anti-IgE (0,05 mg/mL) como controle positivo mediado por IgE.
5. Prepare o alérgeno/medicamento em PBS-T em 2x a concentração final desejada.
   nota: As concentrações ótimas de alérgenos/medicamentos a serem utilizadas devem ser previamente determinadas usando uma ampla gama de concentrações, por curvas dose-resposta e por estudos de citotoxicidade seguindo as mesmas etapas do protocolo.

2. Preparação da mistura de coloração

1. Adicione anticorpos monoclonais marcados com fluorocromo ao tampão de estimulação seguindo a concentração de anticorpos recomendada pelo fabricante ou por titulação anterior de anticorpos. Neste protocolo, adicionamos 1 μL de cada anticorpo (CCR3-APC e CD203c-PE para identificação de basófilos; CD63-FITC para ativação de basófilos) por 20 μL de tampão de estimulação.
   nota: Proteja a preparação da mistura de coloração da luz.
2. Adicione 23 μL de mistura de coloração a cada tubo.

3. Estimulação sanguínea

1. Adicione 100 μL de PBS-T aos tubos 1 e 2 (controle negativo), 100 μL de fMLP ao tubo 3, 100 μL de anti-IgE ao tubo 4 e 100 μL das diferentes concentrações de alérgenos/medicamentos aos seguintes tubos. Incubar durante 10 min a 37 °C num banho termostático com agitação média para pré-aquecer os reagentes.
2. Adicione suavemente 100 μL de sangue a cada tubo para evitar hemólise. Agitar suavemente os tubos e incubar durante 25 min a 37 °C num banho termostático com agitação média.
3. Pare a degranulação, mantendo os tubos a 4 °C por pelo menos 5 min.
   nota: O protocolo pode ser pausado aqui a 4 °C por 30-45 min, se necessário.

4. Lise de eritrócitos

1. Adicione 2 mL de tampão de lise 1x a cada tubo para lisar eritrócitos. Vortex cada tubo e incubar por 5 min em RT.
   nota: Nesta etapa, as células são fixadas devido a agentes fixadores (formaldeído) contidos no tampão.
2. Centrifugue a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Transvasar o sobrenadante, virando a grelha para um lavatório. As células permanecem no fundo dos tubos.
3. Adicione 3 mL de PBS-T a cada tubo para lavar as células. Vórtice cada tubo.
4. Centrifugue a 300 x g a 4 °C por 5 min. Transvase o sobrenadante, transformando o rack em uma pia.
   nota: Manter as amostras a 4 °C, protegidas da luz até à aquisição do citómetro de fluxo.

5. Aquisição por citometria de fluxo

1. Adquira amostras por citômetro de fluxo (por exemplo, citômetro de fluxo BD FACSCalibur). Conecte o citômetro de fluxo ao software do computador e espere que o citômetro esteja pronto. Carregue as configurações do modelo e do instrumento (Tabela 1).
2. Inicie a aquisição de amostras.
3. Use as seguintes estratégias de citômetro para a seleção de basófilos ativados.
   1. Bloqueie os linfócitos do gráfico de dispersão lateral (SSC) - dispersão direta (FSC).
   2. Bloqueie os basófilos da população de linfócitos como células CCR3 ⁺ CD203c ⁺. Adquira pelo menos 500 basófilos por tubo.
   3. Mostre um gráfico CCR3 - CD63 para analisar a ativação usando CD63 como marcador de ativação. Defina o limite negativo de CD63 para aproximadamente 2.5% usando os tubos de controle negativo.
   4. Adquira todas as amostras.

Tabela 1: Requisitos do citômetro de fluxo

Fontes de luz (lasers)	Laser de íons de argônio refrigerado a ar Coherent SapphireTM de 488 nm; 20 mW; Laser refrigerado a ar JDS UniphaseTM HeNe de 633 nm; 17 mW
Comprimento de onda excitatório da luz	Laser azul: 488 nm; Laser vermelho: 633 nm
Potência da fonte de luz no comprimento de onda excitatório	Laser azul: 20 mW; Laser vermelho: 17 mW
Filtros ópticos	SSC: 488/10; FITC: 530/30, PE: 585/42, APC: 660/20
Detectores ópticos	FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, FL4-H APC
Detectores ópticos tye	Laser de íons de argônio refrigerado a ar
Caminhos ópticos	Octógono BD (linha de laser de 488 nm); BD Trigons (linha de laser de 633 nm)

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL, sem tampa, não estéril	Corning	352008
Anticorpo anti-CD193 humano (CCR3) da APC	BioLegend	310708
Citômetro de fluxo BD FACSCalibur	BD Biociências
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016
Anticorpo anti-CD63 humano FITC	BioLegend	353006
HEPES (1 M)	Thermo-Fisher	15630106
Solução de Lise 10x concentrada	BD Biociências	349202
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	M8266
N-Formil-Met-Leu-Phe	Sigma-Aldrich	F3506
Anticorpo anti-CD203c (E-NPP3) anti-humano	BioLegend	324606
Cloreto de potássio	Sigma-Aldrich	Pág. 9541
IgE anti-humana de camundongo purificada	BD Biociências	555857
IL-3 humana recombinante	Sistemas de P&D	203-IL
Fluido da bainha	BD Biociências	342003
cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S3014
TUBO 9 mL LH Heparina de Lítio	Greiner Bio-One	455084
Pré-adolescente 20	Sigma-Aldrich	Pág. 1379

PE