$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparando agulhas de microinjeção
- Prepare agulhas de injeção capilar de vidro de parede fina (1.0 OD / 0.75 ID) usando um dispositivo extrator de micropipeta com as seguintes configurações: pressão de ar 200, calor 502, tração 90, velocidade 80, tempo 70, tempo de ar no início da tração 5, tempo de ar no final da tração 5.
- Usando uma pinça fina, quebre a ponta da agulha puxada de modo que a abertura da ponta tenha um diâmetro de aproximadamente 10 μm.
2. Preparando pratos de injeção de larvas
- Enxágue um pente de gel com uma largura de pista de aproximadamente 4-5 mm em água estéril e deixe secar.
- Prepare uma solução de agarose de alto ponto de fusão a 1,5-2% em meio E3 e leve ao microondas até que a solução esteja límpida. Depois de esfriar, despeje um pouco da agarose em uma placa de Petri (100 x 15 mm) e gire, adicionando agarose apenas o suficiente para cobrir completamente o fundo da placa.
- Assim que a camada de agarose solidificar, coloque o pente de gel enxaguado e seco por cima, de modo que a extremidade não penteada fique apenas apoiada no topo da placa de Petri e a extremidade penteada toque a agarose. Certifique-se de que o pente esteja o mais horizontal possível, criando um ângulo de 30° em relação à camada inferior de agarose.
- Despeje uma pequena quantidade adicional de agarose na interface entre o pente e a camada inferior de agarose, de modo que a camada de agarose fresca cubra os poços do pente. Deixe esfriar completamente antes de remover o pente. Usando uma ponta de pipeta, remova todos os pedaços pendentes de agarose dos poços.
- Despeje o meio E3 em cima do molde de injeção e armazene a 4 °C.
- Antes de cada utilização, substitua por rampas de injeção médias e quentes frescas a 28,5 °C durante pelo menos uma hora antes da injeção.
- Imediatamente antes das injeções, substitua o E3 na rampa de injeção por um meio E3 contendo 200 μg/ml de 3-aminobenzoato de etilo (tricaína).
3. Preparando o inóculo de Streptococcus iniae (S. iniae)
- Prepare e autoclave o meio de caldo Todd Hewitt suplementado com 0,2% de extrato de levedura e 2% de peptona de proteose (THY+P): 30 g/L de Todd Hewitt, 2 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona de proteose. Para placas de ágar, adicione 14 g/L de ágar.
- Preparar as culturas bacterianas na noite anterior às infecções, pipetando uma alíquota de 100 μl de caldo bacteriano congelado para 10 ml de caldo THY+P num tubo selado de 15 ml. Incubar durante a noite sem agitação a 37 °C. Após 14-16 horas de crescimento, use a cultura durante a noite para fazer caldos de freezer ou preparar para uso em injeções.
- Faça caldos congeladores colocando 1 ml da cultura noturna em 500 μl de glicerol a 80% em um tubo de centrífuga de 1,7 ml. Para evitar ciclos de congelamento e descongelamento, faça alíquotas de uso único de 100 μl a partir dessa mistura e armazene-as a -80 °C.
- Para S. iniae usado em infecções, dilua a cultura noturna 1:100 para um volume total de 10 ml de cultura, adicionando 0,1 ml de cultura noturna a 9,9 ml de caldo THY+P. Crescer a 37 °C sem agitação durante aproximadamente 4-5 horas. Monitore a densidade óptica (OD) a 600 nm usando um espectrofotômetro Nanodrop e colha as bactérias em uma fase logarítmica intermediária quando o OD600 nm atingir 0,250-0,500. Um OD600 nm de 0,250 corresponde a aproximadamente 108 unidades formadoras de colônias (UFC) / ml.
- Pellet 1 ml da cultura bacteriana em um tubo de centrífuga de 1,7 ml a 1.500 x g por 5 min. Ressuspenda em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato fresco (PBS) e repita. Meça o OD600 nm da bactéria em PBS, pellet e ressuspenda em PBS para atingir a concentração desejada.
- Para auxiliar na visualização da microinjeção, adicione vermelho de fenol às suspensões bacterianas antes da injeção para uma concentração final de 0,1%.
- Para experimentos envolvendo a injeção de bactérias mortas pelo calor, aqueça as bactérias em PBS a 95 ° C por 30 min. Confirme que o processo de morte pelo calor reduziu o número de bactérias viáveis a níveis indetectáveis por meio de um volume de injeção (aproximadamente 1 nl) em placas sólidas de ágar THY+P e incubação durante a noite a 37 °C.
4. Rotulagem de S. iniae com um corante fluorescente vermelho CellTracker
- Para rotular células bacterianas vivas, prepare uma solução estoque de um corante fluorescente CellTracker ou equivalente. Como o corante usado vem em alíquotas de 20 x 50 μg de pó e precisa ser ressuspenso em dimetilsulfóxido (DMSO), adicione 7,3 μl de DMSO ao tubo para obter uma concentração de estoque de 10 mM.
- Teste uma variedade de concentrações de corante (por exemplo, 0,5-25 μM) nas bactérias para determinar a concentração ideal mais baixa que mancha as células. Células que se dividem rapidamente e experimentos mais longos podem exigir uma concentração maior de corante.
- Pellet 1,0 ml de cultura bacteriana em um tubo de 1,7 ml por centrifugação conforme descrito acima (seção 3). Ressuspenda o pellet em 1 ml de PBS fresco e adicione o volume apropriado de corante à cultura bacteriana.
- Incubar sem agitação a 37 °C durante 30 min. Centrifugar as bactérias e ressuspender em 1 ml de caldo THY+P pré-aquecido e incubar sem agitação durante mais 30 min a 37 °C.
- Gire as bactérias e lave-as duas vezes em PBS antes de medir o OD600 nm e diluir as bactérias para microinjeção conforme detalhado acima (seção 3). Normalmente, injetamos aproximadamente 100 UFC em 1 nl de volume de injeção para nossos estudos de recrutamento de leucócitos e fagocitose.
5. Preparação de larvas de peixe-zebra para infecções
- Estabeleça casais reprodutores na noite anterior e colete embriões conforme descrito por Rosen et al.Incubar embriões em meio E3 a 28,5 °C até que estejam prontos para infectar.
- Para o peixe-zebra que será fotografado, evite o desenvolvimento de pigmento (melanização) adicionando N-feniltioureia (PTU) ao meio E3 24 horas após a fertilização (hpf) para uma concentração final de 0,2 nM.
- Para infecções envolvendo embriões com 2 dias de idade após a fertilização (dpf), descorione os embriões manualmente com uma pinça fina. Alternativamente, descorione os embriões removendo E3 e substituindo-os por pronase (2 mg / ml) por cerca de 5 min ou até que uma pipetagem suave quebre os embriões do córion. A maioria das larvas deve ter eclodido naturalmente em 3 dpf.
- Anestesiar o peixe-zebra vários minutos antes da infecção, colocando larvas descorionadas em um meio E3 contendo 200 μg / ml de tricaína.
6. Injeção de Vesícula Ótica de S. iniae em Larvas de Três Dias de Idade
- Ligue o microinjetor e defina o intervalo de tempo para "milissegundos". Abra a válvula no tanque de dióxido de carbono para deixar o gás entrar na linha. A pressão do microinjetor deve ser de aproximadamente 20 libras por polegada quadrada (PSI). Ajuste a pressão na unidade microinjetora girando no sentido horário o botão serrilhado preto para aumentar a pressão ou girando no sentido anti-horário para diminuir a pressão.
- Vortex a cultura de S. iniae preparada em vermelho de fenol e PBS e use uma ponta de microcarregador para carregar 2-3 μl da cultura em uma agulha de injeção capilar puxada.
- Monte a agulha carregada em um micromanipulador conectado a um suporte magnético e posicione-a sob um estereomicroscópio de forma que a agulha fique em um ângulo de aproximadamente 45-65° em relação à base do microscópio.
- Pressione o pedal do microinjetor para dispensar uma gota do inóculo na ponta da agulha. Meça o diâmetro da gota usando a barra de escala na lente ocular do microscópio.
- Alternativamente, estime o diâmetro da gota injetando um volume em uma gota de óleo mineral em uma lâmina de microscópio de vidro com uma barra de escala. O diâmetro da gota deve ser de aproximadamente 0,10 mm, o que equivale a cerca de 1 nl de volume.
- Ajuste o tamanho da gota ajustando a configuração de duração no microinjetor ou cortando mais a ponta da agulha com uma pinça fina. Observe que o tempo de injeção deve estar entre 20 e 35 ms para evitar causar muitos danos aos tecidos.
- Usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira 12 larvas anestesiadas para cada poço do molde de injeção.
- Use uma haste de vidro, laço de cabelo ou ponta de plástico para posicionar suavemente as larvas de modo que as cabeças fiquem apontadas para a parte de trás do microscópio e os sacos vitelinos. Aponte a orelha esquerda da larva para o teto.
- Olhando através da lente ocular do estereomicroscópio, use os botões do micromanipulador para alinhar a agulha carregada com a vesícula ótica para que ambas fiquem no mesmo campo de visão. Perfure a camada epitelial externa da vesícula ótica com a ponta da agulha para que a ponta da agulha fique dentro da vesícula.
- Pressione o pedal para injetar 1 nl da dose desejada de S. iniae. Certifique-se de usar uma pressão baixa o suficiente para não romper a cavidade. Se a injeção for bem-sucedida, a vesícula ótica, mas não o tecido circundante, deve ser preenchida com o inóculo vermelho de fenol (Figura 1 Ai). Remova imediatamente qualquer peixe injetado incorretamente da placa de injeção.
- Retraia cuidadosamente a agulha para fora da larva e mova a placa de injeção manualmente para que a próxima larva fique à vista. Faça isso com ampliação de 5X.
nota: A retração da agulha pode resultar na deposição de algumas bactérias fora da vesícula ótica, o que pode distorcer a sobrevivência e os resultados de recrutamento de leucócitos. Para evitar isso, recomenda-se injetar bactérias marcadas com corante fluorescente e escanear visualmente as larvas injetadas sob um microscópio fluorescente para remover quaisquer larvas onde isso tenha ocorrido. Uma larva injetada corretamente é mostrada em (Figura 1 Bi).
- Para garantir que o volume/inóculo da injeção permanece o mesmo ao longo do experimento, injete uma gota da suspensão bacteriana em um tubo de centrífuga de 1,7 ml contendo 100 μl de PBS estéril a cada 48embriões. Colocar os 100 μl em placas de ágar-ágar THY+P a 37 °C durante a noite para determinar o UFC no volume de injeção.
- Quando todo o grupo de 12 larvas na rampa de injeção tiver sido injetado, use cuidadosamente uma pipeta de transferência de plástico para remover as larvas dos poços e coloque-as em uma nova placa de Petri (35 x 10 mm2). Remover a solução de tricaína e substituí-la por cerca de 2 ml de meio E3 fresco para permitir a recuperação das larvas.
- A pipeta injetou larvas em poços únicos de uma placa de 96 poços e incubou a 28,5 ° C. Monitore as larvas ao longo do tempo para sobrevivência nessas placas ou remova-as posteriormente para imagens ou contagens de UFC.
7. Fixação de larvas para imagem
- Fixe as larvas em uma solução gelada de paraformaldeído a 4% em PBS, conforme descrito na seção 7.
- À temperatura ambiente, lave 3 vezes por 5 min cada em PBS antes de fazer a imagem.
8. Preparação de larvas para imagens ao vivo
- Prepare uma solução de agarose de baixo ponto de fusão a 1,5% em E3, aquecendo-a no micro-ondas até que a solução esteja límpida.
- Colocar a solução de agarose num banho-maria a 55 °C para deixar arrefecer mas não endurecer.
- Adicione tricaína à agarose até uma concentração final de 0,016%.
- Usando uma pipeta de transferência de plástico, coloque 4-5 larvas anestesiadas em um prato com fundo de vidro no palco de um estereomicroscópio.
- Retire a solução de tricaína e agarose do banho-maria a 55 °C e deixe arrefecer à temperatura ambiente durante 1-2 min. Enquanto a agarose esfria, remova o máximo possível de líquido das larvas anestesiadas.
- Despeje a agarose resfriada no prato até que cerca de metade da superfície esteja coberta. Agite o prato para espalhar a agarose. Observe que, se a agarose estiver muito quente, ela matará as larvas. Além disso, se muita agarose for adicionada ao prato, a lente objetiva do microscópio pode atingir o fundo do prato ao focar através da agarose.
- Usando uma pipeta de transferência, pegue as larvas que flutuaram para as laterais do prato e pipete-as de volta para o centro.
- Sob o estereomicroscópio, posicione suavemente as larvas conforme desejado com um laço de cabelo, uma ponta de pipeta longa ou uma haste de vidro. Para imagens da vesícula ótica, posicione as larvas de forma que a vesícula ótica esquerda fique plana contra o fundo do prato.
- Deixe a agarose esfriar por cerca de 10 minutos antes de mover o prato. As larvas podem mudar de posição se a agarose não for sólida. Pipete suavemente um pouco de solução de tricaína e E3 para o topo da camada de agarose para mantê-la úmida.
9. Imagem Confocal da Infecção
- Coloque o prato de fundo de vidro com larvas no palco de um microscópio invertido com um sistema confocal de varredura a laser FV-1000.
- Defina o orifício para 200-300 μm e, usando uma lente objetiva de abertura numérica de 0,75/20X, defina pilhas z com fatias de 3-6 μm.
- Use a varredura de linha contínua para ajustar a potência do laser e o ganho do detector para cada canal.
- Usando varredura de linha sequencial para cada canal de fluorescência (por exemplo, 488 e 543 nm) e contraste de interferência diferencial (DIC), conduza um filme de lapso de tempo da vesícula ótica esquerda a cada 3 minutos por 2-6 horas para observar o recrutamento inicial e a fagocitose por neutrófilos e macrófagos. Para cursos de tempo mais longos, coloque uma tampa na placa de Petri para evitar a evaporação e o ressecamento da agarose.
- Adquira imagens estáticas de larvas fixas (Figura 1B) ou vivas (Figura 2) com ampliação de 20X ou 40X.
10. Fotoconversão de leucócitos marcados com Dendra2 na vesícula ótica
NOTA: Dendra2 pode ser fotoconvertido de fluorescência verde para vermelha focalizando um laser de 405 nm (50-70% da potência do laser deve ser suficiente) na região de interesse (ROI) por 1 min. Abaixo está o protocolo passo a passo usado para o sistema confocal de varredura a laser FV-1000:
- Visualize a amostra usando uma varredura z-stack com os lasers de 488 nm e 543 nm. Use a varredura de linha contínua para ajustar a potência do laser e o ganho do detector. Verifique se não há fluorescência vermelha fotoconvertida acidentalmente.
- Na janela "Controle de aquisição de imagem", em "Configuração de estímulo", selecione a ferramenta "Usar scanner" e escolha "Principal". Selecione o laser de 405 nm e ajuste-o para 70% da potência. Usando a opção círculo, defina o ROI na vesícula ótica.
- Em "Configuração de início de estímulo", selecione "Ativação em série" com uma pré-ativação de 1 quadro e um tempo de ativação de 60,000 mseg. Na janela "Configuração de aquisição" sob o cabeçalho "Time Scan", escolha 2 intervalos de 00:01:00 (um para pré e outro para pós-fotoconversão).
nota: Após a conclusão da varredura da série de lapso de tempo, o Dendra2 deve ter sido fotoconvertido para seu estado fluorescente vermelho.
- Escaneie a amostra por uma pilha z usando os lasers de 488 nm e 543 nm para visualizar a fluorescência vermelha fotoconvertida, bem como qualquer fluorescência verde restante (Figura 3).
