Imagem de fase quantitativa tridimensional para caracterização de subtipos de linfócitos

Resumo

Fonte: Yoon, J. et al. Identificação sem rótulo de subtipos de linfócitos usando imagens de fase quantitativa tridimensionais e aprendizado de máquina. J. Vis. Exp.(2018)

Este vídeo demonstra a identificação sem rótulos da morfologia e bioquímica dos linfócitos por meio de imagens quantitativas de fase 3D. Essa técnica permite uma análise minuciosa dos linfócitos, descobrindo suas estruturas e propriedades internas sem a necessidade de procedimentos de marcação.

Protocolo

1. Citometria de fluxo e classificação de subtipos de linfócitos

NOTA: A classificação de linfócitos dependendo do tipo de célula é essencial para estabelecer os rótulos de tipo de célula verdadeiros (ou seja, corretos) para treinar e testar um classificador de tipo de célula em aprendizado supervisionado. A citometria de fluxo, um método padrão-ouro, é usada para identificar e separar linfócitos.

1. Faça uma mistura de anticorpos de coloração de marcadores de superfície em 100 μL de meio RPMI-1640 fresco [com 10% de FBS, 0,1 μg de CD3e (17A2), CD8a (53-6,7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) e NK1.1 (PK136)] e 0,25 μg de anticorpos CD4 (GK1.5) para atingir os linfócitos T B, CD4⁺ e CD8⁺.
2. Adicionar 100 μL da mistura de anticorpos à suspensão celular.
3. Incube por 25 min no gelo.
4. Lave as células adicionando 5 mL de PBS e centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 ° C, duas vezes.
5. Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de meio RPMI-1640 fresco com 10% de FBS e 2,5 μg de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindo).
6. Coletar cada tipo de linfócito separadamente com citometria de fluxo usando os níveis de fluorescência dos marcadores descritos acima. Exclua simultaneamente células mortas usando os sinais DAPI.

2. 3D Imagem de fase quantitativa

1. Mantenha os linfócitos classificados no gelo durante os procedimentos de imagem, que devem ser concluídos dentro de 5 h (desde o isolamento dos linfócitos do camundongo) para evitar danos celulares e alterações bioquímicas.
2. Selecione um tipo de célula classificado (entre linfócitos T B, CD4⁺ e CD8⁺) e dilua a amostra para 180 células/μL com meio RPMI para condições ideais de imagem (ou seja, uma célula por campo de visão único).
3. Carregue 120 μL da amostra diluída em uma câmara de imagem por injeção lenta. Verifique minuciosamente a presença de bolhas na câmara de imagem com a amostra. Se houver bolhas, remova-as com cuidado, pois elas comprometerão a qualidade das medições.
4. Adquira tomogramas de RI 3D usando um microscópio de fase quantitativa 3D comercial, ou holotomografia, e seu software de imagem.
   NOTA: Informações detalhadas sobre a configuração experimental podem ser encontradas no manuscrito original.
   1. Coloque uma gota de água destilada em cima da lente objetiva do microscópio.
   2. Coloque a câmara de imagem com a amostra no estágio de tradução do microscópio e ajuste sua localização para que a amostra se alinhe com a lente objetiva.
   3. Ajuste as posições axiais das lentes objetiva e condensadora clicando em Foco e Superfície, respectivamente, na guia "Calibração" da perspectiva "Microscópio" do software de imagem.
   4. Alinhe as lentes da objetiva e do condensador clicando em Modo automático. Como alternativa, use o Modo de digitalização e ajuste manualmente as lentes para que os padrões de iluminação fiquem localizados na região central do campo de visão.
   5. Retorne ao Modo Normal e ajuste o estágio de tradução para localizar uma célula no campo de view.
   6. Encontre o plano focal ajustando a posição axial da lente objetiva. O foco perfeito torna o limite da amostra visualizado na tela quase invisível.
   7. Ajuste o estágio de tradução para encontrar um local sem uma célula.
   8. Clique em Calibrar para medir vários hologramas 2D com ângulos de iluminação variados.
   9. Ajuste o estágio de tradução para localizar uma célula no centro do campo de visão.
   10. Vá para a guia "Aquisição" e clique em Instantâneo 3D para medir os hologramas da célula com ângulos de iluminação idênticos, conforme feito na etapa 2.4.8.
   11. Quando os dados adquiridos forem apresentados no painel "Gerenciamento de dados", clique com o botão direito do mouse nos dados adquiridos e clique em Processar para reconstruir um tomograma 3D RI a partir dos hologramas medidos nas etapas 2.4.8 e 2.4.10, usando o algoritmo de tomografia por difração implementado no software de imagem.
   12. Repita as etapas 2.4.5 a 2.4.11 para medir mais de 100 células para garantir o poder estatístico para o aprendizado de máquina.
   13. Todas as imagens processadas através do passo 2.4.11. podem ser visualizadas. No painel "Gerenciamento de dados", clique com o botão direito do mouse nos dados e clique em Abrir para visualizá-los. Clique em Tomografia RI no painel "Gerenciador de dados". Na guia "Predefinição", clique em Carregar e clique duas vezes em "lymphocyte.xml", que é uma função de transferência predefinida fornecida pelo software de imagem para visualizar o tomograma de acordo com as distribuições 3D RI.
5. Repita as etapas 2.2-2.4 para medir tomogramas 3D IR de todos os subtipos de linfócitos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Citometria de fluxo	BD Biociências	Ária II ou III
Câmara de imagem	Tomocube, Inc.	TomoDish
Holotomografia	Tomocube, Inc	HT-1H
Software de imagem holotomográfica	Tomocube, Inc.	TomoStudio
Software de processamento de imagens	Obras de Matemática	Matlab R2017b
Tubo de centrífuga cônico Falcon	ThermoFisher Scientific	14-959-53UMA	15 mL
Solução salina tamponada com fosfato	Sigma-Aldrich	806544-500ML
Tampão de lise de cloreto de amônio-potássio	ThermoFisher Scientific	A1049201
RPMI-1640 médio	Sigma-Aldrich	R8758
Soro fetal bovino	ThermoFisher Scientific	10438018