Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto
1. Coleta de sangue de pacientes
CUIDADO: Tome as medidas de segurança laboratorial apropriadas ao coletar sangue total do paciente. Use luvas e óculos. Se o paciente estiver isolado, siga os procedimentos de nível de biossegurança 4.
- Para coletar sangue total intravenoso do paciente, use uma agulha borboleta com tubo de extensão de pequeno calibre e um tubo de vácuo de coleta de sangue contendo um tampão de lise/ligação. Descanse o braço do paciente em uma posição para baixo e posicione o tubo de coleta abaixo da agulha borboleta. Insira a agulha borboleta na veia do paciente e conecte o tubo de vácuo de coleta de sangue à extensão de pequeno calibre.
nota: Isso evitará o refluxo.
- Após a coleta de sangue, misture o conteúdo do tubo invertendo-o 5 a 10 vezes.
nota: Devido ao vácuo restante no tubo de coleta de sangue contendo 1,6 mL de lise/tampão de ligação, o volume da amostra coletada será automaticamente de 1,6 mL.
- Desinfete a parte externa do tubo com etanol a 70%.
- Incubar os tubos por 20 min em temperatura ambiente.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui e os tubos de coleta de sangue cheios podem ser armazenados a -20 °C, 5 °C, 25 °C ou 37 °C por pelo menos 1 mês.
- Continue diretamente para o método de extração NA simplificado.
2. Extração simplificada de NA do sangue total
- Para purificar o NA do sangue coletado inativado por lise / tampão de ligação, misture o conteúdo do tubo girando o tubo de vácuo manualmente 5 - 10x.
- Remova a tampa do tubo com cuidado e descarregue a tampa.
- Despeje a alíquota preparada de MGPs (1 mL) diretamente no tubo de coleta de sangue.
- Coloque uma nova tampa de um tubo de coleta de sangue não utilizado no tubo que contém a amostra.
- Coloque um dedo na tampa para garantir que o tubo esteja bem fechado e misture o conteúdo do tubo virando o tubo de coleta de sangue manualmente 5 a 10 vezes.
- Coloque o tubo no suporte magnético e mantenha um dedo na tampa para garantir que o tubo esteja bem fechado.
- Vire o suporte magnético com o tubo algumas vezes com a mão para certificar-se de que todos os MGPs sejam coletados na lateral do tubo com o ímã.
nota: O suporte magnético pode ser substituído por um ímã alongado e um elástico.
- Remova a tampa do tubo e descarte o conteúdo do tubo usando uma pipeta descartável ou simplesmente despejando o conteúdo em um tubo de coleta de 50 mL.
nota: Evite aerossóis do tubo de coleta de 50 mL fechando o tubo com uma tampa.
- Despeje a alíquota preparada de tampão de lavagem-1 (WB-1, 4 mL) diretamente no tubo de coleta de sangue.
- Coloque a tampa no tubo e coloque um dedo na tampa para garantir que o tubo esteja bem fechado.
- Remova o tubo do suporte magnético, mantendo a tampa bem apertada com um dedo.
nota: Se estiver usando um ímã e um elástico, basta remover o elástico e o ímã do tubo.
- Ressuspenda os MGPs girando o tubo de coleta de sangue manualmente 5 a 10 vezes.
- Repita as etapas 2.6 a 2.8.
- Despeje a alíquota preparada de WB-2 (1,5 mL) diretamente no tubo de coleta de sangue.
- Coloque a tampa no tubo e remova-o do suporte magnético.
nota: Se estiver usando um ímã e um elástico, basta remover o elástico e o ímã do tubo.
- Coloque um dedo na tampa para garantir que o tubo esteja bem fechado.
- Ressuspenda os MGPs girando o tubo de coleta de sangue por alguns segundos com a mão.
- Repita as etapas 2.6 a 2.8.
- Despeje a alíquota preparada de WB-3 (3 mL) diretamente no tubo de coleta de sangue.
- Coloque a tampa no tubo e remova-o do suporte magnético.
nota: Se estiver usando um ímã e um elástico, basta remover o elástico e o ímã do tubo.
- Coloque um dedo na tampa para garantir que o tubo esteja bem fechado.
- Ressuspenda os MGPs girando o tubo de coleta de sangue manualmente 5 a 10 vezes.
- Repita as etapas 2.6 a 2.8.
- Despeje a alíquota preparada de tampão de eluição (EB, 100 μL) diretamente no tubo de coleta de sangue.
- Coloque a tampa no tubo e remova-o do suporte magnético.
nota: Se estiver usando um ímã e um elástico, basta remover o elástico e o ímã do tubo.
- Ressuspenda os MGPs no EB batendo no tubo de coleta de sangue 5 a 10 vezes com um dedo.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui e os tubos podem ser armazenados a -20 °C.
- Transfira uma gota (5 - 8 μL) dos MGPs ressuspensos para a mistura de reação de amplificação de NA a jusante usando uma pipeta descartável de 1,5 mL (qualquer ensaio de amplificação de NA de diagnóstico a jusante, como amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP)/LAMP de transcrição reversa (RT-LAMP) ou ensaios quantitativos de reação em cadeia da polimerase (qPCR)/RT-qPCR podem ser usados).
nota: Os NAs ficarão presos aos MGPs, portanto, certifique-se de usar os MGPs na reação de amplificação de NA a jusante. Misture a suspensão MGP antes de usar. Após a mistura, os MGPs serão coletados no fundo do tubo.
