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1. Preparação de lipossomas
- Calcular a quantidade de soluções-mãe suspensas por clorofórmio de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-cap biotinil (Biotina-PE) para obter existências diluídas na concentração final desejada. Para fazer concentrações finais de 400 μM de DOPC e 80 μM de fosfolipídios de Biotina-PE a 10 ml cada, comece colocando 629 μl de 10 mg/ml de DOPC e 88 μl de 10 mg/ml de Biotina-PE em tubos separados de cromatografia de vidro.
NOTA: é importante limpar as seringas de vidro Hamilton e os tubos de cromatografia de vidro com solução de limpeza (1 L de etanol a 95% para 120 ml de água contendo 60 g de hidróxido de potássio, KOH) durante a transferência da solução-mãe suspensa por clorofórmio de DOPC e Biotina-PE.
- Seque o clorofórmio com uma corrente de argônio na capa química. Selar o tubo de cromatografia com parafilme.
- Submeta os lipossomas recém-secos a um alto vácuo em um liofilizador durante a noite (O/N) para remover qualquer clorofórmio residual. Para conclusão no mesmo dia, seque por 60-90 min.
- Enquanto o liofilizador funciona, prepare um pouco de tampão de diluição. Para este protocolo, prepare 25 ml consistindo de 25 mM Tris, pH 8,0; NaCl 150 mM; e detergente n-octil-β-D-glucopiranosídeo (OG) a 2% (em peso). Misture os dois primeiros ingredientes primeiro, depois substitua o oxigênio com argônio antes de adicionar o pó OG seco. Após a preparação, filtre a solução OG com membrana de acetato de celulose de 0,2 mícron e armazene a 4 ° C.
- Além disso, prepare dois frascos com tampa de rosca de 1 L de tampão trissalino nas mesmas concentrações, mas sem OG. Coloque uma barra de agitação magnética destilada e limpa com água no fundo de cada uma. Prepare 6 litros adicionais do tampão trissalino. Remova o oxigênio de todas as garrafas com argônio e coloque-as também a 4 ° C.
- Após a liofilização, dissolva os lipídios secos no tampão Tris-salino OG para fazer uma solução 4 mM de cada um. Seguindo os volumes de exemplo, adicione 2 ml ao tubo DOPC e 0,2 ml ao tubo de Biotina-PE.
- Misture os lipídios de biotina-PE com os lipídios DOPC. Isso melhora a mobilidade do SLB, pois a biotina acoplada pode prejudicar a fluidez dos grupos de cabeça de fosfato. Para fazer uma concentração final de 80 μM de Biotina-PE, misture 0,2 ml de 4 mM de Biotina-PE e 1 ml de 4 mM de DOPC. Em seguida, adicione 8,8 ml do tampão Tris-salino OG.
- Para uma concentração final de 400 μM DOPC, basta misturar 1 ml de 4 mM DOPC com 9 ml de Tris-salina OG.
- Encha o sonicador com água gelada. Coloque o tubo de vidro contendo o fosfolipídio diluído no centro do sonicador usando um grampo utilitário. Sonicar o fosfolipídio diluído por 10 min até que a solução fique límpida.
nota: Adicione gelo ao banho-maria do sonicador para manter a temperatura baixa, pois a sonicação gerará calor.
- Encha os tubos com argônio para deslocar o oxigênio do ar e sele-os com parafilme.
2. Diálise de lipossomas
- Corte duas seções de tubo de diálise seco (corte de peso molecular: 12-14.000, diâmetro: 6,4 mm) de comprimento apropriado (neste exemplo, 40 cm), uma para cada diluição de fosfolipídios, do rolo.
- Reidrate as seções do tubo, deixando-as de molho em 200 ml de água destilada em um copo de vidro por 2 min.
- Microondas por 5 min em uma configuração alta, ou pelo menos até que a água comece a ferver.
- Dê um nó em uma extremidade de cada tubo e enxágue o interior com alguns mililitros de tampão Tris-salino-OG. Depois disso, esprema meticulosamente o máximo possível desse tampão de lavagem para minimizar a quantidade de tampão restante no interior.
- Em uma capela de fluxo laminar, adicione os fosfolipídios diluídos em cada tubo e prenda as extremidades abertas com um pequeno fechamento do tubo de diálise de modo a excluir todo o ar. A exclusão completa do ar exigirá o sacrifício de um pequeno volume da amostra por fixação abaixo da "linha d'água".
- Mergulhe as amostras nos frascos previamente preparados de tampão tris-salino sem OG. Deslocar o oxigénio no frasco com árgon antes de voltar a selar e colocar para mexer O/N a 4°C.
- Transfira o tubo para um novo frasco de tampão trissalino sem OG a cada 12 h por pelo menos 3 vezes.
- Pouco antes da remoção dos lipídios dialisados, prepare vários pequenos tubos para alíquota dos lipídios, preenchendo cada um com argônio para deslocar o oxigênio.
- Após 36 h, leve os frascos de diálise para a capela de fluxo laminar e remova os tubos de diálise dos frascos. Tenha uma fralda de bancada ou copo à mão para coletar o escoamento úmido.
- Corte o tubo de diálise acima do clipe, remova o clipe e transfira cuidadosamente a solução lipídica dialisada via pipeta para alíquotas de 1 ml em tubos pré-preparados cheios de gás argônio no gelo.
- Alíquota da solução aquosa de lipossomas e use o fluxo de argônio para deslocar o oxigênio novamente em cada tubo.
- Armazenar os lipossomas a 4°C. Não congele.
3. Isolando e cultivando células NK humanas
- Alíquota de 15 ml de sangue periférico ou leucemia para um tubo cónico de 50 ml. Dilua esse sangue com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 1% de soro fetal bovino (FBS) na proporção de 1:1.
- Adicionar 13 ml de Ficoll suavemente ao fundo do tubo com uma pipeta serológica de 10 ml.
- Centrifugue este tubo por 20 min a 1.200 x g com o acelerador e a quebra ou em suas configurações mais baixas.
- Após a centrifugação, use uma pipeta sorológica para coletar a camada intermediária branca turva flutuante de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), que deve ficar e a interseção entre uma camada superior amarela clara e uma camada inferior de cor pálida mais turva, ambas acima de uma camada inferior de glóbulos vermelhos (RBCs). NOTA: Não colete nenhuma hemácia na coleta dos PBMCs.
- Colocar os PBMCs recolhidos num novo tubo cónico de 50 ml e diluir até à capacidade máxima com PBS contendo 1% de FBS. Centrifugue novamente, desta vez com o freio e o acelerador no máximo, por 5 min a 300 x g.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de PBS contendo 1% de FBS.
- Contar as células centrifugando mais uma vez com as mesmas regulações do passo 3.6.
- Rejeitar mais uma vez o sobrenadante e ressuspender as células em meio R10 a uma densidade de 10 milhões de células/ml.
- Pegue 30 milhões de células em um tubo de poliestireno de 5 ml e isole as células NK usando um kit de separação magnética, seguindo as instruções do fabricante. Após o isolamento, conte as células mais uma e ressuspenda a uma densidade de 500.000 células/ml em meio R10 completo (88% meio do Roswell Park Memorial Institute, RPMI; 10% FBS; 1% N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-ácido etano sulfônico, HEPES; 1% piruvato de sódio) suplementado com IL-2 (100 U/ml). Cultivar a 37° em uma incubadora de CO2 e substituir o meio 2-3 vezes por semana.
4. Montagem da Bicamada Lipídica Planar Suportada em Vidro
- Prepare 100 ml de solução de piranha misturando peróxido de hidrogênio a 30% com ácido sulfúrico na proporção de 1:3 em um béquer.
nota: Sempre realize trabalhos com agentes nocivos como ácido sulfúrico em uma capela de exaustão química devidamente designada.
- Nesta solução, mergulhe 2 lamínulas retangulares # 1,5 em solução de piranha por 20-30 min.
nota: É essencial limpar as lamínulas com uma solução de piranha.
- Enquanto as lamínulas estão sendo limpas, pegue 1 tubo de lipídios DOPC 400 μM previamente preparados e 1 tubo de lipídios Biotina-PE 80 μM previamente preparados. Transporte-os no gelo para o tanque de argônio.
- Substitua o oxigênio em um novo tubo de microcentrífuga com argônio e, em seguida, adicione o DOPC e a biotina-PE na proporção de 1:1. O volume específico varia de acordo com as necessidades experimentais, mas deve ser de no mínimo 2 μl cada. Substitua o oxigênio no tubo de mistura mais uma vez com gás argônio e também os tubos reagentes individuais, antes de recolocá-los na geladeira.
- Depois de terminar a limpeza, enxágue bem as lamínulas com água destilada. Coloque as lamínulas para secar ao ar por alguns minutos.
- Retirar 1,5 μl da mistura de lipossomas preparada no passo 5.4 e alíquota numa única gota para uma das câmaras de pista da lâmina da câmara. O uso de 2 quedas por pista é típico, mas não necessário.
- Coloque a lamínula seca de forma rápida e eficiente sobre as gotas. Certifique-se de que as gotas estejam suficientemente espaçadas para que não se fundam depois que a lamínula for colocada. Além disso, certifique-se de que as gotas permaneçam circulares e bem definidas, sem tocar nas bordas das paredes da câmara. Pressione firmemente entre e ao redor de cada pista para garantir uma vedação estanque entre a lamínula e a corrediça.
- Marque as posições das gotas usando um marcador.
- Passe 100 μl de caseína aquosa a 5% pela câmara para bloquear a bicamada. Tente certificar-se de que não há bolhas na câmara de fluxo.
- Injetar 100 μl de estreptavidina a uma concentração de 333 ng/ml em cada pista. Incube por 10-15 min em temperatura ambiente (RT). Em seguida, lave passando 3 ml de solução salina tamponada com HEPES (HBS) / albumina sérica humana (HSA) a 1% em cada pista para remover o excesso de estreptavidina.
- Adicione 100 μl de anti-CD16 marcado com fluorescência biotinilada, como Alexa Fluor 568, na concentração de proteína previamente determinada como mais eficaz. Incube no escuro por 20-30 min. Lave novamente passando 3 ml de HBS / 1% HSA em cada pista.
- Fluir 100 μl de D-biotina a uma concentração de 25 nM através da câmara para ligar qualquer excesso de estreptavidina e, assim, eliminar a chance de ligação não específica da estreptavidina às células.
- Conte as células NK e ressuspenda a uma concentração de 500.000 / ml em HBS / 1% HSA.
- Enquanto gira as células, lave a D-biotina para fora da câmara com mais 3 ml de HBS / 1% HSA por pista.
- Verifique a mobilidade dos ligantes no SLB por recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (recuperação de fluorescência após fotobranqueamento, FRAP) em uma fluorescência de reflexão interna total (TIRF) ou microscopia confocal antes de adicionar células NK.
- Quando as células terminarem de girar e forem ressuspensas na concentração desejada, adicione 100 μl a cada pista.
- Coloque a câmara em uma incubadora de 37° 5% CO2 por 30-60 min.
- Após este período de incubação, fixe as células com paraformaldeído a 4% em RT por 10-20 min. Lave passando 3 ml de PBS por cada pista para remover o paraformaldeído.
- Adicione 400 μl de tampão de bloqueio (5% de soro de burro normal e 0,2% de Triton X-100 em PBS). Incubar em RT por 30 min.
- Corar F-actina e perforina adicionando 200 μl de faloidina diluída marcada com fluorescência (1 unidade / ml de faloidina marcada) e anticorpo monoclonal anti-perforina marcado com fluorescência (500 ng / ml de mAb anti-perforina). Incubar em RT por 1 hora.
- Lave com 3 ml de PBS. A câmara está pronta para a obtenção de imagens.
5. Imagem da sinapse NK na bicamada lipídica usando STED
- Ligue todos os módulos de hardware necessários.
- Inicie o software de análise de imagem. Habilite os módulos de varredura ressonante e STED. Depois de fazer essas seleções, aguarde cerca de 3-5 minutos para que o software seja iniciado.
- Clique na guia "Configuração" na parte superior da tela.
- Selecione "Laser Config" e ligue a luz branca e os lasers STED 592 nm.
- Escolha a objetiva de 100x e alinhe o feixe de laser de excitação com o laser de depleção de 592 nm.
- Selecione o módulo "Laser Config", desligue o laser de depleção 592 e ligue o laser de depleção de 660 nm.
- Coloque o slide sobre o palco, sobre a lente. Focalize as células ligadas na região demarcada da bicamada, utilizando a lâmpada de luz branca e as oculares.
- Retorne à guia "Aquisição", diretamente à direita da guia "Configuração".
- Clique na guia "Alternar para Whitelight", ligue esse módulo e arraste a linha de laser de excitação para o comprimento de onda apropriado.
- Selecione o detector desejado na lista de detectores disponíveis e, em seguida, defina a faixa de detecção para abranger a faixa apropriada de comprimentos de onda.
nota: NUNCA coloque a faixa de detecção diretamente abaixo do feixe de excitação.
- Clique no botão "Seqential" na barra de ferramentas "Adquirir" à esquerda para abrir a caixa de diálogo Varredura sequencial na parte inferior da barra de ferramentas à esquerda. Isso permite que o usuário adicione várias sequências, cada uma com um feixe de excitação diferente para uma cor diferente. Clique em "Entre quadros" e defina a frequência de excitação, o detector e a faixa de detecção para cada cor adicional, conforme as etapas 5.9 e 5.10.
- Depois que todas as configurações estiverem otimizadas, clique em "Iniciar" para iniciar o processo de aquisição.