1. Preparação dos controles
- Transfira o seguinte para tubos de 1,5 ml separados e devidamente rotulados:
- Adicione 500 μL de IMDM fresco contendo células K562 marcadas com DiO ressuspensas no tubo de 1,5 mL marcado com "Double Positive".
- Adicione 500 μL de IMDM fresco contendo células K562 marcadas com DiO ressuspensas no tubo de 1,5 mL rotulado com "DiO apenas".
- Adicione 500 μL de IMDM fresco contendo células K562 não marcadas ressuspensas no tubo de 1,5 mL marcado com "Iodeto de Propídio (PI)" rotulado.
- Coloque os tubos Double Positive e PI-only em banho-maria a 55 °C durante 5 min.
- Após os 5 minutos, remova os tubos e limpe-os com etanol a 70%.
- Adicione 10 L de PI aos tubos Double Positive e PI apenas 1,5 mL.
- Coloque todos os três controles de célula-alvo K562 na incubadora a 37 ° C por 30 min.
- Após o término da incubação de 30 minutos, centrifugue todos os três controles da célula-alvo K562 por 2 min a 163 x g.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
- Ressuspenda cada controle com 20 μL de meio de cultura de células IMDM fresco e deixe na incubadora a 37 °C com 5% de CO2 por pelo menos 30 min para obter o sinal DiO ideal.
nota: Os controles agora estão prontos para serem executados através do citômetro de fluxo de imagem.
2. Preparação da amostra de ensaio de citotoxicidade
- Prepare e rotule tubos de 1,5 mL para cada amostra/participante de acordo.
- A pipeta desejava a proporção de células NK e células K562 marcadas com DiO em cada tubo.
NOTA: Por example, a proporção desejada de células-alvo K562 e células efetoras NK é de 1:5.
- Centrifugue por 5 min a 135 x g.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
- Ressuspenda a mistura de células K562 marcada com NK-DiO em 500 μL de meio de células NK sem interleucina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanol (2-ME) (meio de cultura de células NK incompleto).
NOTA: O meio de cultura de células NK incompleto é o meio essencial mínimo Eagle com bicarbonato de sódio, sem L-glutamina, ribonucleosídeos e desoxirribonucleosídeos.
- Adicione 5 μL de PI a cada tubo.
- Centrifugue por 2 min a 163 x g.
- Incubar as células a 37 °C durante 2 h.
- Após 2 h de incubação, centrifugue por 2 min a 163 x g.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
- Ressuspenda as células em meios de cultura de células NK incompletos de 25 μL.
3. Preparação da amostra espontânea ("S")
- Pipete 500 μl de células K562 marcadas com DiO (concentração de 1 x 106 células/mL) em um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 10 μL de PI a cada tubo.
- Tubo de centrífuga por 2 min a 163 x g.
- Incubar as células a 37 °C durante 2 h.
- Após 2 h de incubação, centrifugue por 2 min a 163 x g.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet celular.
- Ressuspenda as células em meios de cultura de células de meio essencial alfa-mínimo (α-MEM) incompletos.
4. Aquisição de dados com citômetro de fluxo de imagem
- Pressione o botão verde dentro da porta frontal do citômetro de fluxo de imagem para ligar o instrumento.
- Ligue todos os computadores associados ao citômetro de fluxo de imagem.
- Inicie o software do citômetro de fluxo de imagem.
- Clique no botão "Inicializar" para liberar o sistema e preparar a linha de amostra.
- Quando a "Inicialização" estiver concluída, feche a janela "Calibrações".
- Atribuir canais: no canto superior esquerdo, clique em cada canal para atribuí-los.
- No lado direito, clique no botão de gráfico de dispersão para criar 4 gráficos de dispersão: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Comece a analisar as amostras usando primeiro o controle "Duplo Positivo".
- Clique em "Carregar".
- Coloque o tubo de 1,5 ml com a amostra "Duplo Positivo" das Etapas 1.4 a 1.8 no sample carregador.
- Selecione a objetiva 40X na guia "Ampliação".
- Ligue os lasers de 405 mW e 642 mW.
- Ligue o canal "Campo claro".
- Clique em "Selecionar intensidade".
- Com base na amostra de controle "Duplo Positivo", determine a intensidade desejada para o laser de 405 mW para que o detector não fique sobrecarregado.
nota: Por exemplo, a intensidade ideal para este experimento foi definida em 11 mW.
- Depois que a configuração desejada for alcançada, adquira dados.
- Na guia "Aquisição de arquivo", insira um texto de nome de arquivo personalizado. Selecione uma pasta para salvar o(s) arquivo(s) de dados.
- Digite o número de células a serem adquiridas ao lado de "Coletar". Normalmente, esse número varia entre 1.000 e 10.000.
- Clique em "Adquirir"
NOTA: Uma vez adquirido o número desejado de células, o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente.
- Após a conclusão da aquisição, carregue a próxima amostra de controle – controle somente DiO.
- Clique em "Carregar".
- Coloque o tubo de 1,5 mL com a amostra "DiO only" no sample carregador.
- Deixe a objetiva 40X na guia "Ampliação" selecionada.
- Deixe o laser de 405 mW ligado.
- Desligue o laser de 642 mW e o canal "Campo claro".
NOTA: Agora que a configuração desejada foi alcançada, os dados podem ser adquiridos.
- Na guia "Aquisição de arquivo", insira um texto de nome de arquivo personalizado e selecione uma pasta para salvar o(s) arquivo(s) de dados. Digite o número de células a serem adquiridas ao lado de "Coletar". Normalmente, esse número é 1.000.
- Clique em "Adquirir"
nota: Uma vez adquirido o número desejado de células, o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente.
- Repita a etapa 4.10 para a amostra de controle "PI only". As amostras experimentais estão prontas para serem coletadas.
- Manuseie as amostras experimentais restantes, incluindo as "Amostras 'S' espontâneas" da seguinte forma:
- Deixe a objetiva 40X na guia "Ampliação" selecionada.
- Ligue os lasers de 405 mW e 642 mW.
- Ligue o canal "Campo claro".
- Clique em "Definir intensidade".
- Na guia "Aquisição de arquivo", insira um texto de nome de arquivo personalizado e selecione uma pasta para salvar o(s) arquivo(s) de dados. Insira um texto de nome de arquivo personalizado.
- Digite o número de células a serem adquiridas ao lado de "Coletar".
- Clique no botão "Adquirir".
nota: Uma vez adquirido o número desejado de células, o arquivo de dados é salvo automaticamente na pasta selecionada anteriormente.
- Repita a etapa 4.12 para todas as amostras experimentais.
- Depois que todos os dados e arquivos experimentais forem coletados, clique no botão "Desligar" para esterilizar o sistema.
5. Análise de amostra de citômetro de fluxo de imagem
- Abra o aplicativo de software de análise de citômetro de fluxo de imagem.
- Em "Arquivo", abra um experimental. RIF.
- Construa uma nova matriz usando uma única cor. RIF (controle somente DiO e controle somente PI, criados durante as etapas 4.10 e 4.11) selecionando "Criar uma nova matriz" na guia Compensação no software do citômetro de fluxo de imagem.
NOTA: O software solicitará a seleção dos arquivos de cor única e os mesclará para criar um arquivo de matriz (extensão de arquivo .ctm), que deve ser selecionado para aplicar a compensação de canal.
- Crie gráficos de pontos usando a função "blocos de construção" do software.
- Crie um gráfico de pontos (BrightFieldGradient_RMS vs frequência) para bloquear as células focadas. Chame o portão de "Foco" (Figura 1A).
- Usando a porta "Foco", crie um gráfico de pontos de Área de campo claro vs Proporção de campo claro para bloquear as células singlete. Chame o portão de "Único" (Figura 1B).
- Usando a porta "Single", crie um gráfico de pontos de Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Use este gráfico para identificar e bloquear células apenas DiO-positivas (alvos, vivas) e células PI-DiO duplamente positivas (alvos, mortos) (Figura 1C).
nota: Todos os gráficos descritos nas etapas 5.4.1, 5.4.2 e 5.4.3 podem ser criados usando a função "blocos de construção" do software.
- Clique na função de estatísticas do gráfico de pontos para acessar os números das células de cada porta.
- Calcule a porcentagem de alvos mortos na amostra espontânea e nas amostras experimentais usando a seguinte fórmula:
% de alvos mortos na amostra = (#dead alvos x 100)/(#live alvos + #dead alvos)
- Calcular a citotoxicidade utilizando a seguinte fórmula:
% de citotoxicidade = [(Morto experimental-Morto espontâneo)/(100-Morto espontâneo)]x100
