Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto
1. Preparação geral de PCLS humano e subsequente exposição a produtos químicos
NOTA: São necessárias duas pessoas para encher um pulmão. Recomenda-se um registro de vacinação atualizado para hepatite A e B. Os pacientes são rotineiramente rastreados para HCV e HIV antes do transplante de pulmão. Se uma infecção ativa por Mycobacterium tuberculosis for diagnosticada ou suspeita, o pulmão deve ser rejeitado. No entanto, todo o tecido pulmonar humano fresco e as amostras dele derivadas devem ser tratados como potencialmente infecciosos, e devem ser tomadas medidas de proteção correspondentes (máscaras com filtro de partículas (FFP2), óculos de proteção, luvas) para garantir a segurança ocupacional do pessoal. O procedimento leva de 60 a 90 minutos.
- Confirme a integridade do lobo pulmonar humano.
nota: Uma ruptura na pleura impede o preenchimento homogêneo do tecido. O material pulmonar humano deve ser do dia da ressecção. São tolerados períodos de armazenamento de cerca de 2 h à temperatura ambiente (RT) antes de o encher com agarose no gelo. O tecido que usamos neste protocolo é obtido de pacientes submetidos à ressecção. Não é de pacientes falecidos. Se o tecido tiver sido armazenado em gelo, pré-aqueça-o a RT antes de preenchê-lo, caso contrário, a agarose polimerizará imediatamente e nenhum preenchimento homogêneo será possível.
cuidado: Certifique-se de que todas as pessoas em contato com material humano nativo usem roupas de proteção que consistem em jaleco, dois pares de luvas, um boné, uma máscara facial e um par de óculos de segurança. O material humano é potencialmente infeccioso.
- Pesar 7,5 g de agarose com baixo teor de gel e adicioná-lo a 250 mL de água bidestilada Ferva a agarose no micro-ondas até que a agarose se dissolva. Resfrie a aproximadamente 40 °C, dependendo do ponto de fusão e gelificação da agarose.
nota: Vários frascos são necessários, dependendo do tamanho do lóbulo.
- Pré-aquecer e manter o meio de cultura (Tabela de Materiais) a 37 °C.
nota: Se a agarose estiver muito quente, as vitaminas no meio de cultura perderão eficácia e as células serão danificadas. Se a temperatura da solução de meio/agarose for inferior a 37 °C, o processo de gelificação começará e prejudicará o enchimento homogêneo do pulmão. Recomenda-se apenas uma faixa de temperatura de 37 °C a 39 °C.
- Coloque todos os materiais necessários ao seu alcance antes de começar: 5 a 10 pinças, um cateter flexível de aproximadamente 1 m de comprimento, uma seringa adequada (por exemplo, 50 mL) encaixando a conexão ao cateter e uma caixa de gelo cheia de gelo.
- Canule a traqueia/brônquio principal inserindo o tubo de silicone e fixando-o com uma pinça orientada paralelamente ao tubo, de modo que a pinça aperte o tecido ao lado do tubo de silicone sem beliscá-lo. Verifique se o tubo de silicone está fixado no interior e não pode escorregar durante o procedimento de enchimento. Feche todos os outros brônquios, vasos sanguíneos e lesões com pinças, para que nenhuma agarose possa vazar durante o procedimento de obturação.
- Misture um volume equivalente de agarose de baixa gelificação a 3% com meio de cultura em um béquer. Instilar a mistura no pulmão usando uma seringa de 50 mL. Antes de reabastecer a seringa com meio, feche o cateter com os dedos ou uma pinça para evitar bolhas de ar e refluxo de agarose. Encha o lóbulo pulmonar até que esteja totalmente inflado. Toque cuidadosamente a pleura pulmonar na lateral; a pleura deve ser uniforme e dura.
nota: Dependendo do tamanho do lobo pulmonar, podem ser necessários até 2 ou 3 L de solução de agarose/meio.
- Repita as etapas 1.5 - 1.6 para cada brônquio no caso de vários brônquios dentro de uma única amostra.
- Coloque o pulmão no gelo para polimerização da agarose para gelificar por 20 a 40 min, dependendo da quantidade de agarose instilada. Toque cuidadosamente a pleura em vários lados para verificar se está dura e fria, indicando que a polimerização está completa, caso contrário, continue esperando. Os patologistas cortarão o pulmão em fatias, coletarão suas amostras e armazenarão o material pulmonar no gelo para transporte.
- Corte o tecido pulmonar humano em placas de 3 a 5 cm com uma faca afiada.
nota: Use uma nova lâmina para cada pulmão para garantir a nitidez.
- Encha o cortador de lenços com 400 mL de solução salina balanceada de Earle gelada (EBSS). Corte imediatamente os núcleos de tecido cilíndrico das placas pulmonares usando uma chave de fenda semiautomatizada com uma ferramenta de perfuração do diâmetro preferido (por exemplo, 8 mm; 10 mm).
NOTA: Este diâmetro deve ser equivalente ao diâmetro do porta-lenços dentro da máquina.
- Ajuste a espessura das fatias de pulmão para o valor de espessura desejado.
nota: Uma espessura de aproximadamente 250 μm é comumente usada em experimentos de PCLS. O fabricante do cortador de tecido recomenda seu medidor de espessura de fatia de tecido para verificação da espessura da fatia. Alternativamente, a coloração de montagem total combinada com microscopia confocal pode ser usada para determinar a espessura do corte, conforme descrito por Brismar et al.27
- Transfira os núcleos de tecido para o suporte de tecido do cortador de tecido. Coloque o peso (parte do porta-lenços) em cima do núcleo do tecido. Defina a velocidade do braço e a velocidade da lâmina para 6 no cortador de tecidos. Comece a cortar o núcleo do tecido em PCLS.
- Suplementar 500 mL de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) disponível comercialmente: Mistura de nutrientes F-12 DMEM/F12 (1:1) com 5 mL de penicilina (10.000 unidades/mL) e estreptomicina (10.000 μg/mL). Conservar o meio de cultura durante vários dias em condições estéreis no frigorífico. Pré-aqueça apenas o volume necessário do meio.
nota: A penicilina será inativada se mantida a 37 °C por períodos mais longos. Use meio de cultura sem soro e sem corantes, pois a composição do soro varia de lote para lote, e corantes, como vermelho de fenol, podem interferir nos ensaios.
- Encha uma placa de Petri (100 x 15 mm) com 25 mL de meio de cultura gelado. O meio deve ser drenado do cortador de lenços de papel para um béquer abrindo a braçadeira do cilindro de vidro. Transferir as fatias de um copo para a placa de Petri com meio de cultura utilizando um aplicador (por exemplo, alça de inoculação). Coloque a placa de Petri em uma incubadora (37 °C, 5% CO2, 100% de umidade). Deixe o meio aquecer antes das etapas de lavagem.
nota: Todas as etapas adicionais são realizadas em condições estéreis.
- Coloque um filtro de células na placa de Petri para lavar o PCLS. Remover completamente o meio de cultura com uma pipeta serológica de 10 ml através do filtro de células e adicionar 25 ml de meio fresco pré-aquecido a 37 °C. Repita esta etapa 3 a 4 vezes a cada 30 min.
nota: O filtro de células evita que as fatias sejam sugadas para dentro da pipeta, para evitar qualquer dano às fatias.
- Transfira as fatias de pulmão cuidadosamente para uma placa de cultura de 24 poços com um mínimo de 500 μL de meio de cultura para duas fatias por alvéolo. Exponha o tecido pulmonar a substâncias (ver etapas 3.1 - 3.4), por exemplo, por 24 h a 37 °C, 5% CO2.
nota: Para a transferência, use preferencialmente uma alça de inoculação e deixe as fatias flutuarem na alça para evitar danos aos tecidos. Não é necessária mais separação das fatias, pois apenas a falta de meio fresco suficiente induzirá a morte celular nas fatias de tecido. As fatias podem se sobrepor ou se tocar no poço: isso não tem influência na viabilidade do tecido.
- Coloque todo o material humano residual em um frasco plástico com um fixador (por exemplo, formaldeído tamponado a 10%) por pelo menos 24 horas e queime-o no processo de descarte.
Cuidado: O formaldeído é tóxico, execute esta etapa sob um capô.
2. Preparação de soluções para substâncias
NOTA: Prepare as soluções e controles de trabalho imediatamente antes de usar.
Cuidado: Manuseie as substâncias de acordo com as instruções de segurança ou, se desconhecidas, como potencialmente nocivas e siga as precauções de segurança de rotina.
- Dissolver as substâncias solúveis em água directamente no meio de cultura. Para produtos químicos insolúveis ou pouco solúveis, primeiro dissolva a substância nos solventes apropriados, dependendo da solubilidade da substância. Substâncias com solubilidade limitada em água (<0,1 mg/mL) podem ser dissolvidas, por exemplo, em DMSO ou etanol. As concentrações de solventes não tóxicos devem ser determinadas previamente por titulação. Certifique-se de que as substâncias não precipitem da solução quando diluídas no meio.
nota: Soluções de HClPt e lauril sulfato de sódio (SLS) são preparadas.
- Preparar soluções de reserva da substância a 100 vezes da concentração mais elevada desejada no meio de cultura ou no solvente. Pesar 12,5 mg de HClPt e 34,4 mg de SLS e preparar soluções-mãe dissolvendo os produtos químicos em 1 mL de meio de cultura.
nota: Nenhum solvente é necessário para esses produtos químicos.
- Preparar uma diluição final de 1:100 num meio pré-aquecido. No caso de utilização prévia de solvente, esta abordagem resulta na mesma concentração final de solvente para todas as concentrações de substâncias.
- Use a concentração final de solvente (por exemplo, 1% conforme descrito na etapa 2.3) para tratamento de referência de PCLS. Nenhum controle de solvente foi necessário para os produtos químicos mencionados na seção de resultados.
3. Referências positivas e negativas para ensaios de citotoxicidade
- Para todos os ensaios de viabilidade, preparar os seguintes controlos positivos e negativos:
- Controle tecidual: incubar o PCLS em um meio de cultura apenas como referência para o PCLS não tratado por 24 h em condições de cultura de células (37 °C, 5% CO2, 100% de umidade).
- Controlo do veículo (se necessário): incubar o PCLS com a concentração final de solvente como referência para o PCLS tratado apenas com o veículo (ver passo 1.4) durante 24 h em condições de cultura celular (37 °C, 5% CO2, 100% de humidade).
- Controle positivo: incubar PCLS com detergente a 1% em solução tampão por 1 h a 4 °C.
nota: Se o PCLS se tornar incolor, o tecido está morto. A L-lactato desidrogenase total (LDH) é determinada no sobrenadante, com uma absorção de aproximadamente 1,9 - 2,3 (ver etapas 4.1 - 4.4).
4. Ensaio LDH
Nota: O ensaio de LDH é realizado em uma placa de 96 poços com 100 μL de sobrenadante de cultura no total após o período pós-incubação.
- Após a incubação do PCLS com ou sem os agentes de teste, pegue 50 μL de sobrenadante da etapa 1.16 e transfira-o em duplicatas para uma nova placa de 96 poços. Isso gera duplicatas de cada poço tratado de uma placa de 24 poços.
- Preparar a solução de trabalho do reagente LDH imediatamente antes do ensaio. A solução de trabalho consiste na solução catalisadora (liofilizado dissolvido em 1 mL de água bidestilada Para uma placa de 96 poços, misture completamente 125 μL de solução catalisadora com 6,25 mL de solução de corante.
cuidado: Não exponha a solução à luz direta.
- Pipetar 50 μL da solução de trabalho em cada poço que já contenha 50 μL de sobrenadante e incubar a placa por 20 min em RT no escuro. Não é necessária mais mistura.
- Meça a absorção de cada poço a 492 nm (referência: 630 nm) usando um leitor de microplacas. Subtraia a absorção a 630 nm de 492 nm. Esses valores serão usados para o cálculo na etapa 3.5.
nota: Dados confiáveis para avaliação de citotoxicidade podem ser obtidos apenas de tecido viável. A absorção do controlo tratado com detergente deve ser superior a 1.
- Para análise, defina o valor de absorção do controle positivo da etapa 2.1 como 100% e calcule a liberação de LDH nas amostras tratadas em relação ao controle positivo (ou seja, liberação máxima de LDH).