Um ensaio baseado em fluorescência usando linfócitos projetados para triagem de compostos imunomoduladores

Abstract

Fonte: Fouda, A., et al., Um ensaio de linfócitos baseado em fluorescência adequado para triagem de alto rendimento de pequenas moléculas. J. Vis. Exp., (2017).

Este vídeo demonstra a triagem de compostos imunomoduladores por meio de ensaio baseado em fluorescência. Linfócitos T derivados de camundongos transgênicos com de expressão de proteína fluorescente verde são tratados com esses compostos. Os sinais GFP aprimorados e reduzidos permitem a identificação dos efeitos estimulatórios e inibitórios dos compostos, respectivamente.

Protocol

1. Preparação do meio esplenócito e tampão de citometria de fluxo

1. Execute todas as etapas sob uma coifa biológica limpa com 70% de etanol.
2. Remova 70 mL de meio pré-aquecido do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 1x (disponível comercialmente e fornecido em frascos estéreis filtrados de 500 ml) e coloque em um tubo estéril. O meio removido será usado posteriormente no protocolo.
3. Complemente os 430 mL restantes de RPMI 1640 1x com 50 ml de soro fetal bovino inativado (FBS), 5 mL de penicilina/estreptomicina, 5 mL de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano sulfônico (HEPES), 5 ml de aminoácidos não essenciais, 5 mL de piruvato de sódio e 0,05 mL de 2-mercaptoetanol filtrado (1M).
   nota: Pré-aqueça o meio esplenócito usando um banho-maria regulado a 37 ºC para evitar choques térmicos nas células. Isso é importante para evitar a indução de apoptose celular.
4. Para preparar o tampão de citometria de fluxo, adicione 2 mL de FBS a 98 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e mantenha refrigerado até o uso (de preferência dentro de três dias).

2. Geração de Suspensão de Células de Esplenócito a partir de Baços de Camundongos Nur77^GFP

1. Isole assepticamente o baço de um camundongo Nur77^GFP fêmea de 6 a 8 semanas de idade.
   1. Para conseguir isso, trabalhe sob um capuz estéril. Mergulhe o pêlo de rato sacrificado, tesoura e fórceps em etanol a 70%.
   2. Coloque o mouse do lado direito e corte a pele e os músculos do quadrante abdominal superior esquerdo. Inspecione a área da incisão para localizar visivelmente o baço e corte-o. Mantenha o baço em meio de esplenócitos no gelo até que esteja pronto para executar a próxima etapa.
2. Colocar o(s) baço(s) numa placa de Petri de cultura de² células de 10 cm contendo 5 ml de meio esplenócito pré-aquecido.
3. Amasse o baço usando um êmbolo de seringa estéril até que a solução fique turva. Uma matriz de colágeno do baço deve permanecer até o final do procedimento.
4. Após uma extensa trituração em meio de esplenócitos, recolher a suspensão celular e passá-la através de um filtro de células de 70 μm colocado num tubo de 50 ml para filtrar quaisquer detritos ou coágulos.
5. Centrifugue a 500 x g por 5 min. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 2-3 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos produzido internamente ou comercial. Após a pipetagem (2-3 vezes), deixe a suspensão descansar por 20-30 s.
6. Adicione 5 mL de PBS ou um tampão adequado de sua escolha e centrifugue a suspensão celular por 5 min a 500 x g.
7. Remova o sobrenadante (deve ser de cor vermelha, pois contém glóbulos vermelhos lisados) e ressuspenda o pellet celular em 2 ml de meio de esplenócitos.
8. Usando um hemocitômetro, conte o número de células coradas com azul de tripano para diferenciar entre células vivas e mortas (necróticas).

3. Isolamento de células T da suspensão de células de esplenócito

1. Centrifugue a suspensão da célula por 5 min a 500 x g. Ressuspenda as células em meio RPMI sem soro (50 ml da etapa 1.3) para obter uma concentração celular de 10 x 10⁶ células / mL.
2. Transferir as células para um tubo de poliestireno de 5 ml e reservar uma alíquota de 100 μL de esplenócitos para avaliação/comparação da pureza no final da fase de purificação.
3. Adicionar soro normal de rato à suspensão celular a 50 μL/ml, seguido de um cocktail de anticorpos de isolamento de células T (50 μL/ml).
4. Misture a suspensão celular e deixe descansar por 10 min. Esta etapa permite que o coquetel de anticorpos se ligue a todas as células indesejadas.
5. Adicione as esferas rápidas de estreptavidina (esferas magnéticas) por 2,5 min e, em seguida, aumente o volume para 2,5 mL usando o meio sem soro.
6. Coloque o tubo em um ímã de isolamento de célula por 3 min.
7. Transfira a suspensão de células T para um novo tubo de poliestireno segurando o ímã e despejando a solução em um movimento.
   nota: A suspensão isolada contém as células T purificadas. Todas as células indesejadas são mantidas na lateral do tubo ligada às esferas magnéticas de estreptavidina.
8. Contar as células T isoladas usando azul de tripano e um hemocitômetro.
   nota: Nesta etapa, a pureza das células T isoladas pode ser verificada (opcional) analisando a porcentagem de eventos CD3⁺ antes e após o isolamento das células T por citometria de fluxo.
   1. Centrifugar brevemente 1 ml de suspensão de células de esplenócito a 500 x g. Rejeitar o sobrenadante e suspender as células num tampão de citometria de fluxo a uma concentração de 1 x 10⁶ células/ml.
   2. Adicione o anticorpo CD3 anti-camundongo marcado com fluorescência a uma concentração de 1:100. Incubar a 4 °C durante 30 min. Lavar uma vez, centrifugar e ressuspender em tampão de citometria de fluxo (400 μL) para análise por citometria de fluxo.

4. Ativação de células T e a indução da expressão da proteína fluorescente verde (GFP)

1. Semeie as células T, em suspensão, em uma placa de fundo redondo de 96 poços a uma concentração de 2,5 x 10⁵ células/poço.
2. Adicione interleucina recombinante (IL)-7 a 2 ng/mL e esferas magnéticas CD3/CD28 (25 μL/10⁶ células). Mantenha uma parte das células T não tratadas com grânulos para servir como controle negativo para medições posteriores que representam células T não ativadas.
3. Doze horas depois, colha as células T da placa de 96 poços pipetando suavemente a suspensão celular em cada poço para cima e para baixo para quebrar qualquer complexo / agregado de células de esfera. Colete a suspensão de todos os poços em um tubo de poliestireno de 5 mL.
4. Coloque o tubo contendo a suspensão dentro do mesmo ímã de isolamento celular usado anteriormente para a purificação das células T e deixe-o descansar por 5 min.
5. Transfira a suspensão de células T para um novo tubo de poliestireno segurando o ímã e despejando a solução em um movimento.
6. Centrifugue as células a 500 x g por 5 min. Ressuspenda as células em meio fresco de esplenócitos para obter uma concentração de 2 x 10⁶ células / mL.
7. Avalie a intensidade da expressão de GFP por citometria de fluxo (opcional para controle de qualidade) 12 a 24 h após a estimulação em comparação com células T não ativadas. ¹²
   nota: A fluorescência GFP é intrínseca às células T^GFP Nur77 e se manifesta após a ativação bem-sucedida do receptor de células T, TCR.
8. Para avaliação da viabilidade e ativação (opcional) por microscopia, corar as células ativadas com Hoechst 30 minutos antes da análise a uma concentração de 0,2 μg/ml. Adicionar um volume adequado da suspensão celular a uma lâmina de cobertura ou a um alvéolo de uma placa de 384 poços de fundo plano e examinar ao microscópio de fluorescência para avaliar as células vivas. As células mortas não retêm a coloração nuclear.

5. Triagem de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas

1. Prepare uma suspensão celular a 2 x 10⁶ células/mL das células T ativadas (esferas magnéticas ou anticorpos/CD40L) ou grupos não ativados.
2. Placa de 75.000 células/poço em uma placa de 384 poços (volume de 40 μL). Use uma placa de fundo plano de 384 poços com laterais pretas ou uma lâmina de cobertura de microscópio para avaliação de viabilidade e ativação por microscopia fluorescente (etapa de controle de qualidade opcional antes do HTS) usando coloração Hoechst (consulte as etapas 4.8 para obter detalhes).
3. Manualmente ou usando um sistema automatizado, adicione os medicamentos de sua escolha (dissolvidos em 0,5% de dimetilsulfóxido, DMSO) a cada poço.
4. Adicione o veículo (DMSO) aos poços de controle positivo (ativado) e negativo (não ativado). Ajuste a concentração de DMSO para um máximo de 0,5%.
5. Incubar as placas durante 24 h (ou tempo de incubação à escolha) a 37 ºC e 5% de dióxido de carbono, CO₂.
6. No dia da triagem, diluir a solução de coloração Hoechst 33342 (1:3,333; por exemplo, adicionar 10 μL às células nas placas de 384 poços para gerar um volume total de 50 μL). Manchar 30 min antes da análise de GFP adicionando solução de Hoechst para atingir uma concentração de 0,2 μg/mL.
7. Pipete suavemente as células para cima e para baixo para obter uma distribuição homogênea em cada poço.
   nota: Esta etapa é importante no caso de dispensar os medicamentos (etapa 5.3) usando um sistema automatizado, pois as células tendem a se acumular em um lado do poço, oposto à direção do fluxo.
8. Gire as placas a 45 x g por 3 min em temperatura ambiente.
9. Deixe as placas descansarem por 15 min em temperatura ambiente.
10. Execute leituras de placa(s) usando o sistema automatizado de triagem confocal de alto conteúdo (HCS). Carregue a placa na máquina. Defina a objetiva com ampliação de 40X ou superior. Use a câmera #4 para Hoechst (lâmpada UV) e a câmera #1 para GFP (laser 488). Configure a máquina para ler de 6 a 10 campos por poço. Ajuste a máquina para fazer duas leituras sequenciais por campo a 488 nm (para ler GFP) e luz UV (para ler Hoechst). Defina a objetiva com ampliação de 40X ou superior.
    nota: O sistema é um microscópio computadorizado que não requer nenhum ajuste. A distância focal, a intensidade da luz incidente e o tempo de exposição são configurados automaticamente pela máquina.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camundongos Nur77GFP	O Laboratório Jackson	Cepa de camundongo nº 016617	Uma colônia interna foi estabelecida em nosso biotério
96 placas de cultura em U, estéreis	VWR Internacional	10062-902	Ativação de células T usando os grânulos magnéticos
Filtro de células de 70μm, estéril	Corning Inc.	Rolamento 352350	Geração de suspensão de células de esplenócitos
Tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 ml, estéreis	Corning Inc.	352058	Geração de suspensão de células de esplenócitos
Tubos de fundo cónico de polipropileno de 50 ml, estéreis	VWR Internacional	89039-656	Geração de suspensão de células de esplenócitos
Seringa de 10 ml sem agulha, estéril	Becton, Dickinson e Companhia	305482	Para esmagar o baço
Placa de cultura de células de 5 ml, estéril	Greiner Bio-One	627 160	Para esmagar o baço
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	WISENT Inc.	450-200-EL	Componente do meio esplenócito
RPMI 1600 com bicarbonato de sódio e L-glutamina	WISENT Inc.	350-002-CL	Componente do meio esplenócito
Aminoácidos não essenciais MEM	WISENT Inc.	321-010-EL	Componente do meio esplenócito
Ácido livre de HEPES 1 M	WISENT Inc.	330-050-EL	Componente do meio esplenócito
Solução de piruvato de sódio (100mM)	WISENT Inc.	600-110-EL	Componente do meio esplenócito
Soro fetal bovino (FBS)	WISENT Inc.	Nº 080-910	Componente do meio esplenócito e tampão de citometria de fluxo
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	WISENT Inc.	311-010-CL	Componente do tampão de citometria de fluxo
2-Mercaptoetanol (55mM)	Thermo Fisher Científico	Rolamento 21985-023	Componente do meio esplenócito
Kit de isolamento de células T	Tecnologias de células-tronco	Rolamento 19851	Para isolar células T
Grânulos superparamagnéticos do T-ativador CD3/CD28 do rato	Thermo Fisher Científico	11452D	Para ativar células T
Ímã de isolamento celular	Tecnologias de células-tronco	18000	Para isolar as células T e remover as esferas magnéticas
IL-7 murina recombinante	Peprotech	217-17	Para apoiar a sobrevivência das células T durante a ativação
Anticorpo CD3 anti-camundongo	BD Pharmingen	561799	Para corar células T para citometria de fluxo
Biomed FXp	PerkinElmer Inc.	Rolamento A31842	Para ressuspender as células após 24 horas de incubação
Sistema de triagem de alto conteúdo Opera Phenix	PerkinElmer Inc.	HH14000000	Para analisar o sinal GFP/Hoechst