Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Configuração do instrumento
NOTA: A imagem de células levitantes requer que dois ímãs de neodímio de terras raras magnetizados no eixo z sejam colocados com o mesmo pólo voltado um para o outro para gerar um campo magnético. A distância entre os ímãs pode ser personalizada dependendo da intensidade do campo magnético e da densidade dos alvos. Neste caso, os ímãs são separados por um espaço de 1 mm suficiente para a inserção de um tubo capilar de vidro quadrado de 50 mm de comprimento e 1x1 mm. O dispositivo foi impresso em 3D usando um design do AutoCAD, que está disponível mediante solicitação.
- Coloque o microscópio de lado, perfeitamente horizontal.
nota: Um microscópio colocado em uma posição vertical padrão não é diretamente adequado para imagens de objetos levitando devido às posições dos ímãs em relação ao condensador e à objetiva. Essa limitação pode ser contornada colocando o microscópio de lado, perfeitamente horizontal, permitindo que o condensador focalize a luz no capilar e a lente objetiva visualize a célula levitando entre os ímãs, mantendo os requisitos de iluminação da Köhler.
- Apoie e nivele o suporte em uma mesa de placa de ensaio usando 2 ou 3 tomadas de laboratório.
- Para limitar as vibrações, apoie a mesa de tábua de ensaio com borracha damppés de amortecimento.
- Remova a platina e substitua-a por um macaco de laboratório compacto para ajustar a altura do dispositivo de levitação (eixo y) e dois estágios de translação de eixo único; um para ajustar o foco (eixo z) e o segundo para escanear o tubo capilar.
- Conecte o dispositivo de levitação magnética ao conector de laboratório usando dois postes ópticos da minissérie.
2. Ligação de anticorpo a carboxi-micropartículas/grânulos (modificado de um protocolo por PolyAn)
NOTA: Apenas grânulos de baixa densidade (1,05 g/mL) precisam ser revestidos para detecção de Rhesus, Rh(+), mas tanto os grânulos de alta quanto de baixa densidade são revestidos para a detecção de vesículas extracelulares.
- Retire 1 mg equivalente de suspensão de grânulo e adicione em 0,5 mL de tampão de ativação (50 mM de ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico, MES (MW195.2, 9,72 mg em 1 mL)) pH 5,0 e 0,001% de polissorbato-20).
- Adicione 12 μL de cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) recém-fabricado (MW 191,7, 0,28755 g em 1 mL) e 12 μL de 0,3 M Sulfo-N-Hidroxisuccinimida (NHS) (MW 217,14, 0,0651 g em 1 mL) em água gelada.
- Coloque os tubos em um agitador orbital e agite vigorosamente por 1 h em temperatura ambiente para ativar os grupos carboxila nos grânulos.
- Pare a ativação após 1 h adicionando 0,5 mL de tampão de acoplamento (solução salina tamponada com fosfato 10x, PBS ou fosfato 0,1 M pH 7-9).
- Pelete os grânulos centrifugando a 20.000 x g por 10 min ou, se os grânulos não puderem ser peletizados, use um filtro de tubo de centrífuga de 0,45 μm. Aspirar o sobrenadante ou o escoamento.
- Lave as esferas com 1 mL de PBS 10x 3 vezes como na etapa 2.5.
- Calcule 25 μg de anticorpo por mg de grânulos e misture o anticorpo desejado com grânulos ativados até uma concentração final de 0,7-1,0 mg / mL de anticorpos em 10X PBS.
- Coloque os tubos em um balancim de tubo em baixa velocidade. Enrole os tubos suavemente à temperatura ambiente durante a noite para acoplamento.
- Repita a etapa 2.5 e lave as esferas duas vezes com 1 mL de PBS 10x.
- Lave com 0,5 mL de etanolamina 1 M (98% estoque = 16,2 M) em tampão pH 8,0 com 0,02% de polissorbato-20 por 1 h em temperatura ambiente, agitando suavemente.
- Repita a etapa 2.5 e lave as esferas uma vez em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS). Os grânulos podem ser armazenados em 200 μL de DPBS a 4 °C até que sejam necessários.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
3. Coleta e preparação de sangue para detecção de Rh(+)
- Usando um dispositivo de punção de um clique, pique o dedo de um doador Rh(+) e colete 10 μL de sangue em 1 mL de DPBS.
- Corar as células Rh+ com uma coloração fluorescente da membrana plasmática. Opcionalmente, adicione 1 μL de corante fluorescente à suspensão de 1 mL de células Rh+ (diluição 1:1000).
- Incubar as células com o corante fluorescente a 37 °C durante 15 min.
- Pulverize as células girando a 5.600 x g por 15 s e lave 3 vezes usando 1 mL de DPBS. Ressuspender em 1 mL de solução salina balanceada de Hanks (HBSS) com cálcio e magnésio (HBSS++).
- Usando o dispositivo de punção de um clique, pique o dedo de um doador de Rh(-) e colete 2 μL de sangue.
nota: Se estiver preparando mais de 2 condições, colete sangue suficiente para adicionar 1 μL de sangue Rh(-) a cada tubo.
- Preparar os tubos experimentais necessários: Apenas grânulos, controlo de imunoglobulina G (IgG), amostra.
- Apenas grânulos: adicione 174 μL de HBSS++, 1 μL de grânulos de controle IgG, 1 μL de grânulos de alta densidade (1,2 g/mL) e 24 μL de 500 mM Gd3+ (60 mM).
- Controle de IgG: adicione 172 μL de HBSS++, 1 μL de grânulos de controle de IgG, 1 μL de grânulos de alta densidade, 1 μL de sangue Rh-, 1 μL de suspensão de sangue Rh+ corada e 24 μL de 500 mM Gd3+.
- O tubo de amostra adiciona 172 μL de HBSS++, 1 μL de grânulos revestidos com anti-RhD, 1 μL de grânulos de alta densidade, 1 μL de sangue Rh-, 1 μL de suspensão de sangue Rh(+) corada e 24 μL de 500 mM Gd3+.
nota: Grânulos de alta densidade são adicionados às amostras de Rh para referência.
4. Analisando células no dispositivo de levitação magnética
- Execute a inicialização do instrumento de acordo com as instruções do fabricante.
- Carregue 50 μL de sample em um tubo capilar até que o tubo esteja cheio. Sele as extremidades do tubo capilar com selante capilar, certificando-se de que não haja bolhas de ar presentes.
- Carregue o tubo capilar no suporte entre os ímãs superior e inferior. Ajuste a platina e o foco para uma visualização ideal.
nota: As células/grânulos podem levar de 5 a 20 minutos para atingir sua posição de equilíbrio magnético com base em sua densidade e concentração de Gd3+. Quanto maior a concentração de Gd3+, menor o tempo.
