Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Isolamento de células T CD4+ para uma análise de imagem
- Descongele uma alíquota de 1 mL contendo 107 células mononucleares do sangue periférico congeladas (PBMCs) ou células mononucleares de linfonodos (LNMCs) de amostras coletadas. Em um capuz estéril, adicione as células descongeladas a 9 mL de RPMI suplementado com penicilina / estreptomicina e glutamina.
- Centrifugar as células durante 10 min a 300 x g a 4 °C, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de RPMI suplementado contendo 10% de FBS (meio completo). Incubar as células durante a noite numa incubadora de CO2 a 37 °C.
- No dia seguinte, purificar as células T CD4+ por triagem imunomagnética negativa usando um kit disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
- Para medir o número de células T CD4 + recém-purificadas, misture 5 μL da suspensão celular com um volume igual de uma solução de azul de tripano. Carregue um hemocitômetro com uma mistura de azul de tripano e célula e conte as células vivas dentro das 5 seções do hemocitômetro.
- Pegue a média do número de células e determine o número de células na suspensão celular original: o número de células/1 mL = a contagem média x 2 x 104. Se o número total de células isoladas for muito pequeno, use as células como estão, sem contar.
- Centrifugue as células a 300 x g por 10 min e ressuspenda-as em um tampão de ensaio (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na2HPO4, 5 mM D-glicose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2 e 1% de albumina sérica humana) a 105 células/50 μL ou menos e mantenha as células a 4 °C (por 1–2 h) até que estejam prontas para uso nos experimentos.
- Descarte todos os resíduos biológicos de acordo com as diretrizes institucionais relevantes.
- Se desejado como uma população de células de controle, prepare células T CD8 + ativadas a partir de PBMC do sangue do cordão umbilical, coloque 107 células em 5 mL de meio completo em um frasco de cultura T25 coberto com uma mistura de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 a 10 μg / mL e 1 μg / mL, respectivamente.
- No dia seguinte, remova as células ativadas do sangue do cordão umbilical do frasco, lave-as 1x com meio completo fresco e expanda as células na presença de IL-2 recombinante (100 U/mL) por 2 semanas.
- Purificar as células T CD8+ do sangue do cordão umbilical por triagem imunomagnética negativa utilizando o kit disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. Conte as células e troque o meio para o tampão de ensaio, conforme descrito nas etapas 1.3 a 1.6 para células T LN e PB CD8+.
2. Componentes para a preparação das bicamadas lipídicas planares
- Prepare 3 tipos de lipossomas conforme descrito em outro lugar: (a) 0,4 mM de lipossomas DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina), (b) 0,4 mM de lipossomas DOPC contendo 33 mol% de lipídios DOGS-NTA (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil)ácido iminodiacético)succinil] (sal de amônio)), (c) 0,4 mM de lipossomas DOPC contendo 4 mol% de Biotinil-Cap-PE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotina) (sal de sódio)).
- Prepare a solução de caseína a 5% conforme descrito anteriormente.
- Dissolva 5 g de caseína em pó em 100 mL de água ultrapura e adicione 350 μL de hidróxido de sódio 10 M. Agitar tudo num agitador magnético regular a uma velocidade lenta de acordo com a escala disponível, à temperatura ambiente durante 2 h e depois durante a noite a 4 °C. Ajustar o pH a 7,3 e ultracentrifugar a solução durante 2 h a 100.000 x g a 4 °C. Filtrar o sobrenadante com um filtro estéril de 0,22 μm e armazenar a solução em alíquotas a -80 °C.
cuidado: A solução de hidróxido de sódio pode causar queimaduras químicas e pode induzir cegueira permanente ao entrar em contato com os olhos. Use luvas de borracha, roupas de segurança e proteção para os olhos ao manusear este produto químico ou suas soluções.
- Rotule anticorpos anti-CD3 com biotina para produzir moléculas de anticorpos monobiotinilados com uma abordagem descrita anteriormente.
- Prepare uma solução de Biotina-PEO4-NHS em dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,1 mg / mL. Adicione 3,7 μL da solução de Biotina-PEO4-NHS a 1 mg de anticorpo em 0,5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 100 mM de bicarbonato de sódio.
- Incube a mistura por 2 h em temperatura ambiente. Prepare uma solução de éster Alexa Fluor 488 NHS a 10 mg / mL em DMSO. Adicione a solução de éster Alexa Fluor 488 NHS ao anticorpo marcado por Biotina-PEO4-NHS em um excesso molar de 10 vezes.
- Incube a mistura por 1 h em temperatura ambiente com agitação lenta em um agitador magnético comum. Separe o corante não ligado usando cromatografia de exclusão de tamanho.
- Determinar a concentração de anticorpos medindo a densidade óptica da solução de anticorpos a 280 nm (A280). Meça a densidade óptica dos anticorpos marcados a 577 nm (A577).
- Determine a relação corante/anticorpo usando a seguinte equação:
nota: Encontre detalhes adicionais no protocolo do fabricante.
- Expresse uma proteína solúvel recombinante da Molécula de Adesão Intercelular 1 (ICAM-1) em um sistema de expressão de Drosophila, conforme descrito anteriormente.
- Clone, com codificação de cDNA, o ectodomínio de ICAM-1 no vetor de expressão de Drosophila pMT / V5-His com um promotor de metalotioneína induzível para produzir uma proteína recombinante anexada com uma etiqueta His6 na extremidade C-terminal.
- Co-transfecto de células S2 com o plasmídeo contendo ICAM-1 resultante e um vetor de expressão de geneticina (G418). Selecione transfectantes estáveis usando Drosophila Media da Schneider suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e 0,5 mg / mL de G418 por 3 semanas. Expanda as células em meio de inseto livre de soro e induza uma expressão proteica com 0,5 mM CuSO4 por 3 d.
- Concentre o sobrenadante da cultura 10x e dialise contra PBS por meio de um concentrador de fluxo tangencial, conforme descrito anteriormente.
- Aplicar o sobrenadante de cultura concentrado a uma coluna contendo Sepharose com um anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 covalentemente imobilizado e eluir o ICAM-1 ligado com um tampão glicina 50 mM, pH 3,0. Neutralize imediatamente a proteína ICAM-1 eluída com um tampão Tris 2 M, pH 8,0.
- Dialise o material eluído contra PBS, pH 8,0, e adicione o material dialisado a uma coluna contendo Ni-NTA (ácido nitriloacético) agarose. Eluir ICAM-1 solúvel com 200 mM de imidazol, pH 8,0. Dialisar o material eluído contra um tampão PBS, pH 8,0.
- Rotule o ICAM-1 purificado com éster Cyanine5 N-Hydroxysuccinimida (Cy5 NHS) de acordo com as instruções do fabricante.
nota: A melhor proporção final de corante para proteína é de 1:1.
- Produzir fragmentos de Fab a partir de um anticorpo anti-CD107a por digestão de papaína e purificar os fragmentos de Fab por cromatografia de troca iônica, conforme descrito anteriormente. Rotule os fragmentos Fab com éster Alexa Fluor 568 NHS de acordo com as instruções do fabricante.
3. Formação de Bicamadas Lipídicas Planares Suportadas em Vidro
- Prepare uma solução fresca de piranha ácida misturando 140 mL de ácido sulfúrico concentrado e 60 mL de peróxido de hidrogênio a 30%. Lave as lamínulas de vidro para as lâminas de fluxo, mergulhando-as na solução ácida de piranha por 30 min. Segure a lamínula de vidro com pinça tipo tesoura de polipropileno.
cuidado: A solução de piranha é um oxidante extremamente forte. Lembre-se de usar óculos de segurança ou óculos de proteção ou um protetor facial completo junto com luvas grossas de borracha o tempo todo ao manusear a solução. Trabalhe apenas com solução de piranha sob uma hotte. Evite aquecê-lo, transportá-lo ou agitá-lo a qualquer momento durante o uso, pois pode explodir. Colete os resíduos de piranha em uma garrafa de vidro com um orifício contendo chumbo. Entre em contato com o Comitê de Segurança Institucional sobre a utilização adequada dos resíduos.
- Enxágue as lamínulas lavadas 7x com água ultrapura, transferindo-as sequencialmente para copos contendo água doce. Deixe as lamínulas molhadas de lado para deixar a água restante rolar do vidro limpo, deixando o vidro seco para trás.
- Como alternativa, use uma ponta de pipeta conectada a uma bomba de vácuo para remover cuidadosamente as gotas de água restantes das lamínulas.
- No capuz estéril, realize diluições de vários lipídios para produzir a mistura de lipossomas para fazer bicamadas. Primeiro, combine 37 μL de lipossomas DOPC e 3 μL de lipossomas Biotinyl-Cap-PE. Em segundo lugar, misture 14 μL de lipossomas DOPC e 15 μL de lipossomas DOGS-NTA. Terceiro, adicione 1 μL da primeira mistura a 29 μL da segunda mistura para fabricar a mistura final de lipossomas.
- No capô estéril, monte um espaço de trabalho com lamínulas secas por perto. Alíquota 2 μL da mistura final de lipossomas (ver passo 3.3) precisamente no centro de um canal deslizante autoadesivo. Alinhe imediatamente e com muita precisão uma lamínula limpa e seca com o slide e abaixe suavemente a lamínula no lado adesivo do slide.
- Se estiver preparando mais de uma lâmina, trabalhe em uma lâmina de cada vez, pois a mistura de lipossomas evapora rapidamente. Vire a corrediça e use o anel externo da pinça tipo tesoura de polipropileno para aplicar uma leve pressão no contato periférico da lamínula com a corrediça, certificando-se de que a lâmina esteja firmemente presa à corrediça para evitar vazamentos.
nota: Não pressione os canais da corrediça para evitar quebrar ou rachar a lamínula.
- Vire a lâmina novamente e marque a posição da bicamada formada, que se parece com uma gota entre a lamínula e a lâmina do canal, desenhando 4 pontos com um marcador permanente ao redor da bicamada no lado da corrediça externa do conjunto.
- Antes da primeira injeção de um líquido no canal, designe uma porta do canal como porta de entrada e a outra como porta de saída e mantenha essa designação durante todo o experimento.
- Para evitar a formação de bolhas, insira a extremidade da ponta da pipeta diretamente na porta de entrada do canal. Encha lentamente os canais da lâmina com 50 μL de tampão de ensaio quente (pelo menos à temperatura ambiente) (consulte a etapa 1.5 para a composição do tampão).
- Prepare uma solução de cloreto de níquel (II) 0,5 M. Descongelar uma alíquota de 2 ml de solução de caseína em banho-maria a 37 °C durante 30 min e complementá-la com uma solução de cloreto de níquel a uma concentração final de 200 μM.
- Lave as bicamadas injetando primeiro 100 μL da solução de caseína na porta de entrada do canal e, em seguida, removendo imediatamente 100 μL da porta de saída na lâmina por pipetagem. Bloqueie as bicamadas com a mesma solução injetando 100 μL da solução de caseína na porta de entrada de cada canal e incubando a lâmina por 45 min à temperatura ambiente.
- Descongele alíquotas das proteínas Cy5-ICAM-1-His6 e estreptavidina. Combinar as proteínas no tampão de ensaio na concentração final de 2 μg/ml cada. Centrifugue a solução durante 30 min a 20 000 x g e 4 °C para remover quaisquer agregados.
- Remova o restante da solução de bloqueio da porta de saída do canal deslizante pipetando. Injete 100 μL da solução contendo ICAM-1 e estreptavidina na porta de entrada.
- Incube a lâmina por 45 min em temperatura ambiente. Remova qualquer excesso da solução proteica da porta de saída. Lave a bicamada 2x injetando primeiro 100 μL do tampão de ensaio na porta de entrada do canal e, em seguida, removendo imediatamente 100 μL da porta de saída.
- Diluir um anticorpo anti-CD3 marcado com Alexa-Fluor-488 com o tampão de ensaio até uma concentração final de 2 μg/ml. Injetar 100 μL da solução de anticorpos na porta de entrada da lâmina e incubá-la por 45 min à temperatura ambiente. Remova qualquer excesso da solução proteica da porta de saída. Lave a bicamada 2x com 100 μL do tampão de ensaio como na etapa 3.11.
4. Imagem da interação das células T com a bicamada planar
- Pré-aqueça a platina e a objetiva de um microscópio confocal ou de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) até que a temperatura esteja equilibrada a 37 °C. Montar a lâmina com a(s) bicamada(s) na platina aquecida. Mova o stage para uma posição apropriada de acordo com as marcas de tinta e concentre-se na bicamada empregando fluorescência de moléculas ICAM-1 marcadas com Cy.
- Use uma objetiva de 61X para o microscópio confocal ou uma objetiva de 100X para o microscópio TIRF, com configurações de filtro apropriadas.
- Para imagens de liberação de grânulos por microscopia TIRF, adicione fragmentos Fab de anticorpo anti-CD107a marcados com Alexa-Fluor-568 à suspensão celular em uma concentração final de 4 μg/mL antes de injetar as células nas portas de entrada.
- Ressuspenda as células T CD4+ preparadas isoladas do LN PB ou do sangue do cordão umbilical e injete 50 μL da suspensão celular na porta de entrada do canal deslizante que contém a bicamada.
- Escolha o número desejado de campos e grave imagens de cada campo 1x a cada 2 minutos por 30 minutos após a injeção.
- Explore os canais de campo claro, luz refletida e fluorescente (Alexa 488 e Cy5) do microscópio confocal para adquirir as imagens. Use o modo TIRF para fluorescência Alexa-Fluor-488 e Alexa-Fluor-568 e campo amplo para fluorescência Cy5, bem como imagens de campo claro, no microscópio TIRF.
