Uma técnica in vitro para estudar a interação de células T com bicamadas lipídicas planares suportadas

Resumo

Fonte: Steblyanko, M., et al. Avaliação da Interface Sináptica de Células T Humanas Primárias do Sangue Periférico e Tecido Linfóide. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica in vitro para estudar a formação de sinapses imunes entre células T humanas primárias e bicamadas lipídicas suportadas (SLB). As proteínas da superfície das células T interagem com os respectivos ligantes imobilizados no SLB para formar uma sinapse imune, seguida pelo movimento dos grânulos líticos em direção à sinapse, que é visualizado por meio de microscopia de fluorescência.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Isolamento de células T CD4⁺ para uma análise de imagem

1. Descongele uma alíquota de 1 mL contendo 10⁷ células mononucleares do sangue periférico congeladas (PBMCs) ou células mononucleares de linfonodos (LNMCs) de amostras coletadas. Em um capuz estéril, adicione as células descongeladas a 9 mL de RPMI suplementado com penicilina / estreptomicina e glutamina.
   1. Centrifugar as células durante 10 min a 300 x g a 4 °C, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 5 ml de RPMI suplementado contendo 10% de FBS (meio completo). Incubar as células durante a noite numa incubadora de CO₂ a 37 °C.
2. No dia seguinte, purificar as células T CD4⁺ por triagem imunomagnética negativa usando um kit disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
3. Para medir o número de células T CD4 ⁺ recém-purificadas, misture 5 μL da suspensão celular com um volume igual de uma solução de azul de tripano. Carregue um hemocitômetro com uma mistura de azul de tripano e célula e conte as células vivas dentro das 5 seções do hemocitômetro.
4. Pegue a média do número de células e determine o número de células na suspensão celular original: o número de células/1 mL = a contagem média x 2 x 10⁴. Se o número total de células isoladas for muito pequeno, use as células como estão, sem contar.
5. Centrifugue as células a 300 x g por 10 min e ressuspenda-as em um tampão de ensaio (20 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2 mM Na₂HPO₄, 5 mM D-glicose, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ e 1% de albumina sérica humana) a 10⁵ células/50 μL ou menos e mantenha as células a 4 °C (por 1–2 h) até que estejam prontas para uso nos experimentos.
6. Descarte todos os resíduos biológicos de acordo com as diretrizes institucionais relevantes.
7. Se desejado como uma população de células de controle, prepare células T CD8 ⁺ ativadas a partir de PBMC do sangue do cordão umbilical, coloque 10⁷ células em 5 mL de meio completo em um frasco de cultura T25 coberto com uma mistura de anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 a 10 μg / mL e 1 μg / mL, respectivamente.
8. No dia seguinte, remova as células ativadas do sangue do cordão umbilical do frasco, lave-as 1x com meio completo fresco e expanda as células na presença de IL-2 recombinante (100 U/mL) por 2 semanas.
9. Purificar as células T CD8⁺ do sangue do cordão umbilical por triagem imunomagnética negativa utilizando o kit disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante. Conte as células e troque o meio para o tampão de ensaio, conforme descrito nas etapas 1.3 a 1.6 para células T LN e PB CD8⁺.

2. Componentes para a preparação das bicamadas lipídicas planares

1. Prepare 3 tipos de lipossomas conforme descrito em outro lugar: (a) 0,4 mM de lipossomas DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina), (b) 0,4 mM de lipossomas DOPC contendo 33 mol% de lipídios DOGS-NTA (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(N-(5-amino-1-carboxipentil)ácido iminodiacético)succinil] (sal de amônio)), (c) 0,4 mM de lipossomas DOPC contendo 4 mol% de Biotinil-Cap-PE (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(cap biotina) (sal de sódio)).
2. Prepare a solução de caseína a 5% conforme descrito anteriormente.
   1. Dissolva 5 g de caseína em pó em 100 mL de água ultrapura e adicione 350 μL de hidróxido de sódio 10 M. Agitar tudo num agitador magnético regular a uma velocidade lenta de acordo com a escala disponível, à temperatura ambiente durante 2 h e depois durante a noite a 4 °C. Ajustar o pH a 7,3 e ultracentrifugar a solução durante 2 h a 100.000 x g a 4 °C. Filtrar o sobrenadante com um filtro estéril de 0,22 μm e armazenar a solução em alíquotas a -80 °C.
      cuidado: A solução de hidróxido de sódio pode causar queimaduras químicas e pode induzir cegueira permanente ao entrar em contato com os olhos. Use luvas de borracha, roupas de segurança e proteção para os olhos ao manusear este produto químico ou suas soluções.
3. Rotule anticorpos anti-CD3 com biotina para produzir moléculas de anticorpos monobiotinilados com uma abordagem descrita anteriormente.
   1. Prepare uma solução de Biotina-PEO4-NHS em dimetilsulfóxido (DMSO) a 0,1 mg / mL. Adicione 3,7 μL da solução de Biotina-PEO4-NHS a 1 mg de anticorpo em 0,5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 100 mM de bicarbonato de sódio.
   2. Incube a mistura por 2 h em temperatura ambiente. Prepare uma solução de éster Alexa Fluor 488 NHS a 10 mg / mL em DMSO. Adicione a solução de éster Alexa Fluor 488 NHS ao anticorpo marcado por Biotina-PEO4-NHS em um excesso molar de 10 vezes.
   3. Incube a mistura por 1 h em temperatura ambiente com agitação lenta em um agitador magnético comum. Separe o corante não ligado usando cromatografia de exclusão de tamanho.
   4. Determinar a concentração de anticorpos medindo a densidade óptica da solução de anticorpos a 280 nm (A280). Meça a densidade óptica dos anticorpos marcados a 577 nm (A577).
   5. Determine a relação corante/anticorpo usando a seguinte equação:
      
      nota: Encontre detalhes adicionais no protocolo do fabricante.
4. Expresse uma proteína solúvel recombinante da Molécula de Adesão Intercelular 1 (ICAM-1) em um sistema de expressão de Drosophila, conforme descrito anteriormente.
   1. Clone, com codificação de cDNA, o ectodomínio de ICAM-1 no vetor de expressão de Drosophila pMT / V5-His com um promotor de metalotioneína induzível para produzir uma proteína recombinante anexada com uma etiqueta His6 na extremidade C-terminal.
   2. Co-transfecto de células S2 com o plasmídeo contendo ICAM-1 resultante e um vetor de expressão de geneticina (G418). Selecione transfectantes estáveis usando Drosophila Media da Schneider suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) e 0,5 mg / mL de G418 por 3 semanas. Expanda as células em meio de inseto livre de soro e induza uma expressão proteica com 0,5 mM CuSO₄ por 3 d.
   3. Concentre o sobrenadante da cultura 10x e dialise contra PBS por meio de um concentrador de fluxo tangencial, conforme descrito anteriormente.
   4. Aplicar o sobrenadante de cultura concentrado a uma coluna contendo Sepharose com um anticorpo monoclonal anti-ICAM-1 covalentemente imobilizado e eluir o ICAM-1 ligado com um tampão glicina 50 mM, pH 3,0. Neutralize imediatamente a proteína ICAM-1 eluída com um tampão Tris 2 M, pH 8,0.
   5. Dialise o material eluído contra PBS, pH 8,0, e adicione o material dialisado a uma coluna contendo Ni-NTA (ácido nitriloacético) agarose. Eluir ICAM-1 solúvel com 200 mM de imidazol, pH 8,0. Dialisar o material eluído contra um tampão PBS, pH 8,0.
   6. Rotule o ICAM-1 purificado com éster Cyanine5 N-Hydroxysuccinimida (Cy5 NHS) de acordo com as instruções do fabricante.
      nota: A melhor proporção final de corante para proteína é de 1:1.
5. Produzir fragmentos de Fab a partir de um anticorpo anti-CD107a por digestão de papaína e purificar os fragmentos de Fab por cromatografia de troca iônica, conforme descrito anteriormente. Rotule os fragmentos Fab com éster Alexa Fluor 568 NHS de acordo com as instruções do fabricante.

3. Formação de Bicamadas Lipídicas Planares Suportadas em Vidro

1. Prepare uma solução fresca de piranha ácida misturando 140 mL de ácido sulfúrico concentrado e 60 mL de peróxido de hidrogênio a 30%. Lave as lamínulas de vidro para as lâminas de fluxo, mergulhando-as na solução ácida de piranha por 30 min. Segure a lamínula de vidro com pinça tipo tesoura de polipropileno.
   cuidado: A solução de piranha é um oxidante extremamente forte. Lembre-se de usar óculos de segurança ou óculos de proteção ou um protetor facial completo junto com luvas grossas de borracha o tempo todo ao manusear a solução. Trabalhe apenas com solução de piranha sob uma hotte. Evite aquecê-lo, transportá-lo ou agitá-lo a qualquer momento durante o uso, pois pode explodir. Colete os resíduos de piranha em uma garrafa de vidro com um orifício contendo chumbo. Entre em contato com o Comitê de Segurança Institucional sobre a utilização adequada dos resíduos.
2. Enxágue as lamínulas lavadas 7x com água ultrapura, transferindo-as sequencialmente para copos contendo água doce. Deixe as lamínulas molhadas de lado para deixar a água restante rolar do vidro limpo, deixando o vidro seco para trás.
   1. Como alternativa, use uma ponta de pipeta conectada a uma bomba de vácuo para remover cuidadosamente as gotas de água restantes das lamínulas.
3. No capuz estéril, realize diluições de vários lipídios para produzir a mistura de lipossomas para fazer bicamadas. Primeiro, combine 37 μL de lipossomas DOPC e 3 μL de lipossomas Biotinyl-Cap-PE. Em segundo lugar, misture 14 μL de lipossomas DOPC e 15 μL de lipossomas DOGS-NTA. Terceiro, adicione 1 μL da primeira mistura a 29 μL da segunda mistura para fabricar a mistura final de lipossomas.
4. No capô estéril, monte um espaço de trabalho com lamínulas secas por perto. Alíquota 2 μL da mistura final de lipossomas (ver passo 3.3) precisamente no centro de um canal deslizante autoadesivo. Alinhe imediatamente e com muita precisão uma lamínula limpa e seca com o slide e abaixe suavemente a lamínula no lado adesivo do slide.
   1. Se estiver preparando mais de uma lâmina, trabalhe em uma lâmina de cada vez, pois a mistura de lipossomas evapora rapidamente. Vire a corrediça e use o anel externo da pinça tipo tesoura de polipropileno para aplicar uma leve pressão no contato periférico da lamínula com a corrediça, certificando-se de que a lâmina esteja firmemente presa à corrediça para evitar vazamentos.
      nota: Não pressione os canais da corrediça para evitar quebrar ou rachar a lamínula.
   2. Vire a lâmina novamente e marque a posição da bicamada formada, que se parece com uma gota entre a lamínula e a lâmina do canal, desenhando 4 pontos com um marcador permanente ao redor da bicamada no lado da corrediça externa do conjunto.
5. Antes da primeira injeção de um líquido no canal, designe uma porta do canal como porta de entrada e a outra como porta de saída e mantenha essa designação durante todo o experimento.
6. Para evitar a formação de bolhas, insira a extremidade da ponta da pipeta diretamente na porta de entrada do canal. Encha lentamente os canais da lâmina com 50 μL de tampão de ensaio quente (pelo menos à temperatura ambiente) (consulte a etapa 1.5 para a composição do tampão).
7. Prepare uma solução de cloreto de níquel (II) 0,5 M. Descongelar uma alíquota de 2 ml de solução de caseína em banho-maria a 37 °C durante 30 min e complementá-la com uma solução de cloreto de níquel a uma concentração final de 200 μM.
8. Lave as bicamadas injetando primeiro 100 μL da solução de caseína na porta de entrada do canal e, em seguida, removendo imediatamente 100 μL da porta de saída na lâmina por pipetagem. Bloqueie as bicamadas com a mesma solução injetando 100 μL da solução de caseína na porta de entrada de cada canal e incubando a lâmina por 45 min à temperatura ambiente.
9. Descongele alíquotas das proteínas Cy5-ICAM-1-His₆ e estreptavidina. Combinar as proteínas no tampão de ensaio na concentração final de 2 μg/ml cada. Centrifugue a solução durante 30 min a 20 000 x g e 4 °C para remover quaisquer agregados.
10. Remova o restante da solução de bloqueio da porta de saída do canal deslizante pipetando. Injete 100 μL da solução contendo ICAM-1 e estreptavidina na porta de entrada.
11. Incube a lâmina por 45 min em temperatura ambiente. Remova qualquer excesso da solução proteica da porta de saída. Lave a bicamada 2x injetando primeiro 100 μL do tampão de ensaio na porta de entrada do canal e, em seguida, removendo imediatamente 100 μL da porta de saída.
12. Diluir um anticorpo anti-CD3 marcado com Alexa-Fluor-488 com o tampão de ensaio até uma concentração final de 2 μg/ml. Injetar 100 μL da solução de anticorpos na porta de entrada da lâmina e incubá-la por 45 min à temperatura ambiente. Remova qualquer excesso da solução proteica da porta de saída. Lave a bicamada 2x com 100 μL do tampão de ensaio como na etapa 3.11.

4. Imagem da interação das células T com a bicamada planar

1. Pré-aqueça a platina e a objetiva de um microscópio confocal ou de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) até que a temperatura esteja equilibrada a 37 °C. Montar a lâmina com a(s) bicamada(s) na platina aquecida. Mova o stage para uma posição apropriada de acordo com as marcas de tinta e concentre-se na bicamada empregando fluorescência de moléculas ICAM-1 marcadas com Cy.
   1. Use uma objetiva de 61X para o microscópio confocal ou uma objetiva de 100X para o microscópio TIRF, com configurações de filtro apropriadas.
2. Para imagens de liberação de grânulos por microscopia TIRF, adicione fragmentos Fab de anticorpo anti-CD107a marcados com Alexa-Fluor-568 à suspensão celular em uma concentração final de 4 μg/mL antes de injetar as células nas portas de entrada.
   1. Ressuspenda as células T CD4⁺ preparadas isoladas do LN PB ou do sangue do cordão umbilical e injete 50 μL da suspensão celular na porta de entrada do canal deslizante que contém a bicamada.
3. Escolha o número desejado de campos e grave imagens de cada campo 1x a cada 2 minutos por 30 minutos após a injeção.
4. Explore os canais de campo claro, luz refletida e fluorescente (Alexa 488 e Cy5) do microscópio confocal para adquirir as imagens. Use o modo TIRF para fluorescência Alexa-Fluor-488 e Alexa-Fluor-568 e campo amplo para fluorescência Cy5, bem como imagens de campo claro, no microscópio TIRF.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de isolamento de células T CD4, humano	Miltenyl Biotec	130-096-533
Kit de isolamento de células T CD8, humano	Miltenyl Biotec	130-096-495
DOPC	Lipídios Polares Avanti	850375C
CÃES NTA	Lipídios Polares Avanti	790528C
Tampa Biotinyl PE	Lipídios Polares Avanti	870273C
Albumina sérica humana	Octapharma EUA	NDC 68982-643-01
corrediça pegajosa VI 0,4	ibidi	Rolamento 80608
Lamínulas para slides adesivos	ibidi	Rolamento 10812
Câmara Bioptech FCS2	Bioptech	060319-2-03
anticorpo anti-CD3	Thermo Fisher Científico	16-0037-81	Clone OKT3, células de hibridoma estão disponíveis na ATCC
anticorpo anti-CD28	Genetex	GTX14664	9.3 Clone
caseína	sigma	C5890
Biotina-PEO4-NHS	Thermo Fisher Científico	21329
Dmso	sigma	D2650-5
Kit de rotulagem de proteínas Alexa Fluor 488 com coluna para purificação de proteínas rotuladas	Thermo Fisher Científico	Rolamento A10235
Kit de rotulagem de proteínas Alexa Fluor 568 com coluna para purificação de proteínas rotuladas	Thermo Fisher Científico	A10238
Amersham Cy5 NHS Éster	GE Ciências da Vida	PA15101
pMT/V5-His A, B, C Vetores de expressão de Drosophila	Thermo Fisher Científico	V412020
pcopneo, G418 Vetor de expressão de Drosophila para seleção positiva	ATCC	Rolamento 37409
Meio drosófico livre de soro Insect-XPRESS	Lonza	12-730Q
Hiridoma YN1/1.7.4	ATCC	CRL1878	O hibridoma secreta anticorpo contra ICAM-1.
Sepharose ativada por brometo de cianogênio 4B	Sigma-Aldrich	C9142	Utilizado para a preparação de Sepharose com anticorpo anti-ICAM ligado velentemente.
Concentrador de fluxo tangencial MasterFlex	Cole-Parmer	77601-60 7592-40	Usado para ICAM-1 contendo concentração de sobrenadante e diálise de ICAM-1 contendo sobrenadante
Sistemas de fluxo tangencial Centramate Lab	Laboratório Pall	FS002K10 OS010T12 FS005K10	Usado para ICAM-1 contendo concentração de sobrenadante e diálise de ICAM-1 contendo sobrenadante
Ni-NTA Agarose	QIAGEN	30210
Tubos para diálise	Spectra/Por	131384
Papaína de látex de mamão	sigma	Pág. 3125
anticorpo anti-humano de camundongo contra CD107a	BD Bioscences	555798	Clone H4A3
Luvas Ansell Natural Blue	Fisher Científico	19-014-539
Pinça tipo tesoura de polipropileno Nalgene	Thermo Fisher Científico	Nº 6320-0010
Estreptavidina	ProZyme	SA10
Microscópio confocal	Nikon		Microscópio invertido Nikon TiE equipado com PFS para controle de estabilidade de imagem de longo prazo, objetivas de óleo 60x, 4 lasers com linhas de excitação em 405, 458, 488, 514, 561 e 640 nm, 2 detectores GaAsP e 2 PMTs de alta sensibilidade, luz transmitida DIC, estágio X, Y, Z programável para várias posições e costura de grandes áreas, funções de lapso de tempo, Câmara controlada por temperatura e CO2 Tokai-Hit para imagens ao vivo e mesa de isolamento antivibração
Microscópio TIRF	Andor		Sistema Andor Revolution XD equipado com iluminador Nikon TIRF-E, Lasers com linhas 405,488,561 e 640, luz transmitida DIC, cabeça de disco giratório Yokogawa CSU-X1 para imagens confocais, objetiva 100/1.49 NA, câmera Andor iXon X3 EM-CCD, aquecedor de objetiva e platina motorizada piezoelétrica com Perfect Focus System (PFS)