Efeito de um agente farmacológico imunomodulador na interação entre células dendríticas e células T CD4+

Resumo

Fonte: Wei, H., et al. Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas tolerogênicas murinas. J. Vis. Exp. (135), (2018).

Este vídeo demonstra um método de conversão de células dendríticas (DCs) em DCs tolerogênicas (TolDCs) usando um agente farmacológico imunomodulador. Essa conversão é confirmada pela avaliação da função TolDC por meio de seu efeito imunossupressor nas células T CD4+.

Protocolo

1. Avalie a função de TolDCs in vitro e in vivo

1. Ensaio de proliferação singéica de células T
   1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos em autoclavagem e realize o experimento em uma cabine de segurança biológica classe II com procedimentos de segurança apropriados.
   2. Prepare o tampão MACS usando albumina de soro bovino (BSA) a 0,5% e EDTA 2 mM em 500 ml de PBS. Esterilize o tampão filtrando através de um filtro de 0,2 μm.
      nota: Mantenha o tampão no gelo durante o experimento seguinte.
   3. Para obter células T CD4+, eutanasiar camundongos transgênicos com receptor de células T OT-II (TCR) de 8 a 10 semanas de idade usando uma câmara de CO₂. Coloque o mouse em uma placa de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen usando tesouras cirúrgicas e fórceps.
   4. Colocar o baço com 2 ml de PBS numa placa de cultura de 6 cm e utilizar o dorso do bastão de uma seringa de 3 ml para picar o baço passando um coador de células de 40 μm.
   5. Recolha a suspensão celular e centrifugue a 300 x g durante 5 minutos.
   6. Ressuspenda o pellet celular em 400 μl de tampão MACS.
   7. Adicione 100 μl de coquetel de biotina-anticorpo de células T CD4 + a 4 ° C por 5 minutos.
      nota: O coquetel de anticorpos se liga a outros tipos de células, exceto células T CD4+, como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC classe II, Ter-119 e TCRγ/δ.
   8. Adicione 300 μl de tampão MACS e 200 μl de esferas anti-biotina (Tabela de Materiais) a 4 ° C por 10 minutos.
   9. Coloque a coluna composta por esferas ferromagnéticas (Tabela de Materiais) e o Filtro de Pré-Separação juntos no campo magnético e enxágue com 3 ml de tampão MACS.
   10. Adicione 9 ml de tampão MACS nas células e centrifugue a 300 x g por 5 minutos.
   11. Ressuspenda o pellet celular em 3 ml de tampão MACS e aplique-o na coluna. Colete células T CD4 + contendo fluxo.
   12. Lavar a coluna com mais 3 ml de tampão MACS e recolher também o fluxo.
   13. Para obter DCs de panos esplênicos, eutanasiar camundongos C57BL/6 de 8 a 10 semanas de idade usando uma câmara de CO₂. Coloque o mouse em uma placa de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen usando tesouras cirúrgicas e fórceps. Coloque o baço em uma placa de cultura de 6 cm contendo 2 ml de solução de colagenase D (2 mg / ml de colagenase D dissolvida em HBSS contendo cálcio e magnésio).
   14. Injete 1 ml de solução de colagenase D no baço duas vezes com uma seringa de 1 ml e uma agulha 25G. Corte o baço em pedaços pequenos com uma tesoura pequena.
   15. Agite e incube em temperatura ambiente por 25 minutos.
   16. Adicione 500 μl de EDTA 0,5 M em temperatura ambiente por 5 min.
       nota: As etapas de 1.1.13-1.1.14 são críticas para aumentar o rendimento das DCs.
   17. Agora use a parte de trás do bastão da seringa de 3 ml para picar a pasta do baço passando por um filtro de células de 40 μm e colete a suspensão celular centrifugando a 300 x g por 5 minutos.
   18. Ressuspenda o pellet celular em 350 μl de tampão MACS, 50 μl de reagente bloqueador de FcR e 100 μl de coquetel de biotina-anticorpo de células dendríticas a 4 ° C por 10 minutos.
       nota: O coquetel de anticorpos contra antígenos que não são expressos por DCs.
   19. Lave as células adicionando 9 ml de tampão MACS e centrifugue a 300 x g por 5 minutos.
   20. Ressuspenda o pellet celular em 800 μl de tampão MACS e adicione 200 μl de esferas anti-biotina a 4 ° C por 10 minutos.
   21. Repita as etapas de 1.1.9 a 1.1.11 para coletar DCs.
   22. Lave a coluna com mais 3 ml de tampão MACS duas vezes e recolha também o fluxo.
   23. Trate os 2 x 10⁵ DCs / ml na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C por 1 hora. Separadamente, rotule as células T CD4 + (1 x 10⁷ / ml) com 1 μM CFSE a 37 ° C por 15 minutos, lave com PBS e reajuste o volume para obter a concentração final em 2 x 10⁶ células T / ml.
   24. Em seguida, em uma placa de 96 poços, co-cultive 100 μl das células dendríticas tratadas com o mesmo volume de células T CD4 + marcadas com CFSE, ambas coletadas nas etapas acima para obter uma proporção de 1:10. Agora adicione 100 ng/mL de peptídeo de ovalbumina (OVA) 323-329 por poço e meça a intensidade CFSE das células T por citometria de fluxo após 2-3 dias de incubação.
       nota: O número de células e a proporção de DCs e células T foram otimizados em relação ao nosso trabalho anterior.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CDDO-DFPA (RTA-408)	Reata Farmacêutica	síntese interna	Cultura de células
Rato GM-CSF	Peprotech Inc	315-03	Diferenciação BMDC
Kit de isolamento de células dendríticas	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	Ensaio de proliferação de células T
Coquetel de biotina-anticorpo de célula dendrítica Pan	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	Ensaio de proliferação de células T
Kit de isolamento de células T CD4+	Miltenyi Biotec Inc	130-104-454	Ensaio de proliferação de células T
Atendimento ao cliente	BioLegend	423801	Ensaio de proliferação de células T
Reagente de bloqueio FcR	Miltenyi Biotec Inc.	130-100-875	Ensaio de proliferação de células T
Microesferas anti-biotina	Miltenyi Biotec Inc.	130-104-454	Ensaio de proliferação de células T
Seringa de 1 ml	BD Biociências	309626	Ensaio de proliferação de células T
Bsa	Sigma Aldrich Inc	A2058	Ensaio de proliferação de células T
Edta	ThermoFisher Scientific	15575020	Ensaio de proliferação de células T
Coluna LS	Miltenyi Biotec Inc.	130-042-401	Ensaio de proliferação de células T
Filtro de pré-separação	Miltenyi Biotec Inc	130-095-823	Ensaio de proliferação de células T
Colagenase D	Sigma Aldrich Inc.	11088858001	Ensaio de proliferação de células T
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025076	Ensaio de proliferação de células T
Peptídeo de ovalbumina (OVA) 323–329	Sigma Aldrich Inc.	O1641	Ensaio de proliferação de células T