Uma técnica in vitro para visualizar a exocitose de grânulos secretores em mastócitos

Resumo

Fonte: Klein, O., et al. Imaging FITC-dextran como repórter de exocitose regulada J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra uma técnica para visualizar a exocitose em mastócitos. As células são incubadas com FITC-dextrano - um repórter fluorescente - que é absorvido pelas células dentro de grânulos secretores (SGs), onde o pH ácido extingue sua fluorescência. Após a estimulação da exocitose do grânulo, o pH mais alto do meio induz a fluorescência do repórter dentro dos SGs fundidos, que é visualizada usando um microscópio de fluorescência.

Protocolo

1. Preparativos

1. Preparação de meios de cultura RBL (linhagem de mastócitos RBL-2H3)
   1. Misture 500 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco com baixo teor de glicose (DMEM) com 56 mL de soro fetal bovino (FBS), 5,5 mL de solução de penicilina-estreptomicina-nistatina, 5,5 mL de solução de L-Glutamina 200 mM. Isso resulta em DMEM de baixa glicose suplementado com 10% de FBS, 100 μg / mL de estreptomicina, 100 unidades / mL de penicilina, 12 unidades / mL de nistatina e 2 mM de L-glutamina.
   2. Filtrar o meio utilizando um filtro de vácuo superior de 0,22 μm de poros e conservar a 4 °C.
2. Manutenção de células RBL.
   1. Cultive células RBL a uma confluência máxima de 90% em um prato de 10 cm. Se a cultura de células estiver saudável, as células devem ter uma forma de fuso com saliências ocasionais.
   2. Para a divisão celular, retire as células do prato aspirando o meio e substituindo-o por 2 mL de solução de tripsina / EDTA B. Incube por 5-10 minutos em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂ a 37 ° C.
   3. Uma vez que as células tenham se desprendido, neutralize a tripsina adicionando 2 mL de meio de cultura, usando uma pipeta, e divida as células na proporção de 1:2 - 1:10.
3. Preparação de 20x tampão de Tyrode
   1. Prepare uma solução estoque 20x de 54 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 2,74 M NaCl e 8 mM NaH₂PO₄ em água bidestilada (DDW). Misturar bem e conservar a 4 °C.

2. Cultura de células RBL para microscopia de células vivas

1. Preparação da solução de FITC-dextrano.
   1. Misture 1 mg de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-pó de dextrano (150 K) por 1 ml de meio de cultura (ver passo 1.1.1). Para uma lamínula com câmara completa, prepare 3 mL.
   2. Usando uma unidade de filtro de seringa de acetato de celulose com tamanho de poro de 0,22 μm, filtre o FITC-dextrano dissolvido.
   3. Adicione imunoglobulina E (IgE) de camundongo a uma concentração de 1 μg / mL.
2. Semeando células RBL para imagens
   1. No dia anterior à imagem, aspire o meio da placa de cultura e substitua-o por 2 mL de solução de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) B. Incube por 5 a 10 minutos em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂ a 37 ° C. Uma vez que as células tenham se desprendido, neutralize a tripsina adicionando 2 mL de meio de cultura.
   2. Conte as células RBL usando um hemocitômetro e ajuste o volume de acordo com o meio de cultura para obter uma concentração celular de 7,5 x 10⁵ / mL.
   3. Adicione 10 μL da suspensão celular a uma lamínula pré-cheia com meio de cultura suplementado com FITC e dextrano fresco (isso resulta na semeadura de 7,5 x 10³ células em uma câmara).
   4. Cultive células RBL durante a noite em uma atmosfera humificada de 5% de CO₂ a 37 ° C. As células devem permanecer em um nível subconfluente para garantir que as células sejam separadas e que seja fácil identificar cada célula individualmente ao microscópio.
3. Transfecção de células RBL - opcional.
   1. Para imagens de eventos exocíticos em combinação com outras proteínas marcadas com fluorescência, consulte o protocolo de transfecção para células RBL em Azouz et al.

3. Microscopia de Células Vivas de Exocitose

1. Preparação de soluções:
   1. Prepare uma solução tampão final de Tyrode diluindo a solução-mãe em DDW em uma diluição de 1:20 e suplemente com 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl₂, 1 mg / mL de albumina de soro bovino (BSA) e 5,6 mM de glicose.
   2. Prepare um reagente secretagogo 20x no tampão de Tyrode [1 μg / mL de dinitrofenil conjugado à albumina sérica humana (DNP-HAS (Ag)) em nosso caso, para uma concentração de 50 ng / mL 1x].
   3. Prepare uma solução de cloreto de amônio a 400 mM dissolvendo o pó no tampão de Tyrode.
2. Preparação das células.
   1. Lave a lamínula com câmara 3 vezes aspirando o meio da câmara e enchendo-o novamente com 300 μL de tampão de Tyrode, pré-aquecido a 37 °C. Por fim, reabastecer a câmara com 300 μL de tampão de Tyrode, pré-aquecido a 37 °C.
   2. Coloque a lamínula com câmara na câmara da incubadora do microscópio. Certifique-se de que a câmara esteja estável.
3. Configurando o microscópio
   1. Para escolher uma região de interesse para rastrear, ligue a fonte de luz fluorescente (tradicionalmente uma lâmpada de mercúrio) e escolha o filtro de fluorescência apropriado (escolha o filtro para fluoróforos verdes para viewFITC-dextrano). Uma vez que a região de interesse esteja em foco e no meio do campo de visão, desligue a fonte de luz para evitar fotobranqueamento e toxicidade.
      NOTA: Alguns dos FITC-dextranos incorporados nas células podem reter fluorescência. Isso ocorre porque o FITC-dextrano também pode ser classificado em compartimentos não lisossômicos, como endossomos.
   2. Ligue a iluminação apropriada para a excitação do FITC. Se estiver usando um microscópio baseado em laser, ligue o laser de 488 nm. A emissão deve ser coletada em torno de 500 - 550 nm (picos de emissão FITC em 510 - 520 nm).
   3. Ao usar um microscópio confocal, abra o orifício ao máximo. Isso permitirá o uso de menor potência do laser para evitar branqueamento e toxicidade e garantirá a captura de eventos de exocitose de todos os planos da célula.
   4. Calibre o intervalo de tempo entre as aquisições de imagem.
      1. Diferentes células podem variar em sua cinética de exocitose regulada. Para imagens específicas de exocitose composta, recomendamos um intervalo de tempo de pelo menos 5 segundos. No entanto, como regra geral, para permitir imagens rápidas, certifique-se de que o tempo de aquisição de um único quadro seja rápido.
      2. Ao usar um microscópio confocal de varredura a laser, defina a direção da varredura como bidirecional, não permita a média e defina a resolução em 512 x 512 (recomendado; as duas últimas disposições também ajudarão a minimizar o branqueamento e a toxicidade).
4. Imagem da exocitose.
   1. Células de imagem para durações desejadas, dependendo do tipo de célula ou secretagogo. Nas células RBL desencadeadas com IgE/Ag, a maioria dos eventos exocíticos ocorre dentro de 15 a 20 minutos após a ativação.
   2. Para ativação das células, adicione 16 μL da solução secretagoga 20x à câmara.
5. Confirmando a presença de FITC-dextrano nas células.
   1. Para confirmar a presença e localização de FITC-dextrano nos SGs, adicione 16 μL de solução de cloreto de amônio (tome cuidado para não mover a câmara para não perder o foco) à câmara suavemente (isso fará uma concentração final de 20 mM). Isso induzirá a alcalinização dos SGs e a extinção da fluorescência FITC, que ocorrerá em segundos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM baixo teor de glicose	Induções Biológicas	01-050-1A
Soro fetal bovino	Gibco	12657
Solução de caneta-estreptococo-nistatina	Induções Biológicas	03-032-1B
Solução de L-Glutamina 200 mM	Induções Biológicas	03-020-1A
FITC dextrano 150K	Sigma-Aldrich	46946-500MG-F
Solução B de tripsina / EDTA	Induções Biológicas	03-052-1A	Aquecer em banho-maria a 37 °C antes de utilizar
Filtro de vácuo superior de poro de 0,22 μm	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Unidade de filtro de seringa de acetato de celulose, tamanho de poro de 0,22 μm	Sartorius	16534K
Tampa com câmara de vidro	Termocientífico	155411
Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos Corning	Sigma-Aldrich	CLS430167
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	Rolamento A4503
IgE monoclonal anti-DNP	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-HSA (Ag)	Sigma-Aldrich	Resposta A6661	Evite a exposição direta à luz
Tampão hepes 1M, pH 7,4	Induções Biológicas	03-025-1B
CaCl2	Merk	102382
glicose	Laboratórios BDH	284515V
Cloreto de amônio	Merk	1145
PIPES sal dipotássico	Sigma-Aldrich	Rolamento 108321-27-3
Hidrato de acetato de cálcio	Sigma-Aldrich	Rolamento 114460-21-8
Acetato de magnésio tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M5661
Glutamato de potássio (ácido L-glutâmico, sal de potássio monohidratado)	Sigma-Aldrich	G1501
NaH2PO4	Merk	Nº 6346
NaCl	Merk	106404
MgCl2	Merk	105833
Kcl	Merk	104936
Eletroporador	BTX	ECM830
Microscópio confocal, Zeiss	Zeiss	LSM 5 Pascal, Axiovert 200M	Usado na Figura 3. Equipado com um controle eletrônico de temperatura
Incubadora Airstream
Microscópio confocal, Zeiss	Zeiss	LSM 800, Axio Observer.Z1 /7	Usado na Figura 2. Equipado com um detector GaAsP, um detector eletrônico com temperatura controlada
Incubadora Airstream
Microscópio confocal, Leica	Leica	SP5	Usado na Figura 1. Equipado com um detector Leica HyD e uma incubadora de estágio superior (okolab)
Células RBL-2H3			As células RBL-2H3 foram clonadas no laboratório de Reuben P. Siraganian. Ver referência 67