Monitorando a ativação de células B com lipossomas antigênicos usando um ensaio de fluxo de cálcio

Resumo

Fonte: Bednar, K. J. et al., Lipossomas antigênicos para geração de anticorpos específicos para doenças.J. Vis. Exp.(2018)

Este vídeo mostra a avaliação da ativação das células B através da utilização de lipossomas antigênicos. As células B tratadas com corante Indo-1 sensível ao cálcio são distinguidas usando citometria de fluxo e sua relação de fluorescência violeta-azul é analisada. À medida que as células encontram lipossomas antigênicos, ela desencadeia a ativação das células B por meio do influxo de cálcio, aumentando progressivamente a proporção do sinal de fluorescência violeta para azul ao longo do tempo.

Protocolo

1. Conjugação do antígeno proteico com o lipídio PEGulado

1. Adicione 3 g de esferas de gel de dextrano reticuladas com uma faixa de fracionamento de 1.500 a 30.000 Daltons (Da) a um balão a vácuo de 250 mL. Adicione 60 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e mexa continuamente com uma barra de agitação magnética. Fechar o balão e colocá-lo a um aspirador para iniciar a desgaseificação numa placa de agitação durante um mínimo de 1 h.
2. Em uma coluna de cromatografia de vidro de 1,0 cm x 30 cm com a rolha fechada, adicione PBS à coluna para lavar. Abra a rolha de rotação e drene a coluna. Após a lavagem, adicione a pasta de grânulos desgaseificados à coluna. Adicione continuamente a pasta até que a coluna esteja compactada a uma altura de cordão de aproximadamente 24 cm.
3. Uma vez que a coluna tenha uma 'cabeça' de aproximadamente 4–5 cm de PBS acima dos grânulos compactados, tenha as etapas a seguir prontas.
   1. Crie um sifão de fluxo por gravidade medindo um pedaço de tubo longo o suficiente para alcançar uma prateleira de 1 a 2 pés acima do topo da coluna e crie um loop que caia perto da parte inferior da coluna e retorne ao topo da coluna. Adicione uma rolha de rotação em uma extremidade da tubulação, deixando um lado da tubulação aberto. Coloque a extremidade do tubo aberto em um frasco de 500 mL de PBS e coloque-o na prateleira acima da coluna.
   2. Pegue a extremidade com a rolha de rotação e coloque uma seringa de 10 mL. Abra a válvula de rolha de rotação na linha de tubulação e puxe o PBS através do tubo. Quando o PBS atingir três quartos do caminho através do tubo, remova rapidamente a seringa e adicione a rolha de rotação ao topo da coluna - o líquido deve estar escorrendo para a coluna.
      NOTA: A quantidade de 'cabeça' de PBS deixada no topo da coluna deve estar entre 1 e 3 cm. A quantidade mínima para lavar a coluna é de 3 volumes de coluna.
4. Determinar a quantidade de proteína (moles) a ser ligada aos lipídios com base em seu peso molecular (MW).
   NOTA: O fragmento Fab de imunoglobulina anti-camundongo de cabra, IgM (ele próprio um IgG) é usado aqui como um antígeno substituto universal para estimulação policlonal de células B. Assim, o fragmento Fab de IgG caprino tem um MW de aproximadamente 48 kiloDalton (kDa) e está disponível comercialmente em uma quantidade total de 1,3 mg. Assim, a quantidade de proteína a ser ligada é de 27,1 μmol.
5. Determine o coeficiente de extinção da proteína de interesse. Se não for desconhecido, medir a absorvância das proteínas a 280 nm utilizando um espectrofotómetro e dividir o valor de A₂₈₀ pelo número de moles calculado no passo 1.4.
   NOTA: O coeficiente de extinção de Fab de cabra IgG a 280 nm é de 64.600 ^M-1.
6. Para garantir que vestígios do tampão contendo amina sejam removidos, dessalinize a proteína na coluna criada nas etapas 1.1 a 1.3 e colete as frações de proteína em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL (~ 500 μL por fração).
   1. Feche a válvula de retenção conectada ao topo da coluna e remova o topo da coluna. Se ainda não estiver aberto, abra a válvula de rolha de rotação na parte inferior da coluna e espere até que a 'cabeça' do PBS atinja o topo dos grânulos.
   2. Adicione lentamente a proteína de interesse ao topo das contas usando uma pipeta Pasteur de vidro, tomando cuidado para minimizar a perturbação no topo das contas.
   3. Assim que a 'cabeça' da solução de proteína atingir o topo das contas, adicione 1 mL de PBS suavemente por meio de uma pipeta Pasteur. Repita três vezes. Adicione PBS para criar uma cabeça de 4 a 5 cm e repita a etapa 1.3 para lavar a coluna.
      NOTA: Esta etapa pode ser ignorada se houver certeza de que nenhum tampão contendo amina está presente.
7. Determine as frações que contêm proteína medindo os valores de A280 e agrupe as frações que dão aproximadamente 90% de recuperação da proteína.
   NOTA: Isso normalmente dilui a proteína 1,5-2 vezes. Determinar a concentração de proteínas após a agrupação. Concentrar a proteína nesta etapa, se necessário, usando um concentrador de centrifugação.
8. Adicione 2,5 molares equivalentes do reticulador heterobifuncional à proteína.
   1. Em primeiro lugar, pesar cerca de 5 mg de 3-(2-piridilditio)propionato de succinimidil (SPDP, MW = 314 g/mol) num tubo de microcentrífuga. Para determinar o volume para dissolver o SPDP, takmultiplie a concentração de proteína molar e 250x para gerar uma solução de 100x que dará um excesso de 2,5 molares na reação.
      NOTA: Por exemplo, se a concentração de proteína for de 50 μM, é necessária uma solução de SPDP a 12,5 mM. Para 5 mg de SPDP, isso corresponde a 1,27 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
9. Adicione SPDP à proteína de interesse em uma diluição de 1:100. Colocar a reacção num agitador oscilante à temperatura ambiente (RT) durante cerca de 1 h.
10. Para remover o excesso de SPDP e proteger a(s) ligação(ões) dissulfeto(s) endógena(s) na proteína na etapa de redução subsequente, equilibre e lave a coluna criada nas etapas 1,1–1,3 em acetato de sódio (NaOAc) 100 mM a pH 5,5 ou crie uma coluna idêntica exclusivamente para uso neste tampão.
11. Após 1 h de incubação com SPDP, dessalinizar a proteína na coluna equilibrada em NaOAc 100 mM. Efectuar este passo de forma idêntica ao passo 1.6, excepto utilizando 100 mM de NaOAc (pH 5,5) como eluente. Colete as frações, determine o A₂₈₀ e agrupe as frações superiores. Lave a coluna em PBS.
12. Preparar uma solução de 2,5 M de DTT (MW = 154 g/mol) em água bidestilada (ddH₂O). Adicione 25 mM de DTT às frações agrupadas de proteína por 5-10 min.
13. Meça o A₂₈₀ da proteína e divida-o pelo coeficiente de extinção. Além disso, determine o A₃₄₃. Calcule a razão de ligação com base na molaridade da proteína (A₂₈₀) e do ligante (A₃₄₃).
    NOTA: Desligue a calibração automática do A340 se estiver usando um espectrofotômetro nanodrop. A medição A₃₄₃ representa a absorbância do grupo piridina 2-tiona (coeficiente de extinção = 7550 ^M-1) que é removido do reticulador SPDP pelo DTT. Uma razão molar de ligante: proporção de proteína de 1,2–1,5 é geralmente alcançada ao realizar a reação com um excesso molar de 2,5 SDPD em uma ampla gama de proteínas.
14. Execute as frações agrupadas sobre a coluna lavada em PBS conforme descrito acima. Colete as frações, determine o A₂₈₀ e as frações do topo do pool. Determinar a concentração de proteínas em A280 depois de agrupar as frações.
15. Preparar DSPE-PEG (2000)-maleimida (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000)-maleimida. Isso será adicionado à proteína na proporção molar de 10:1. Prepare um estoque de 100x DSPE-PEG (2000) -Maleimide para atingir a concentração desejada.
    1. Por exemplo, se a concentração de proteína for de 10 μM após a etapa 1.14, prepare um estoque de DSPE-PEG(2000)-Maleimide a 10 mM. Pesar cuidadosamente DSPE-PEG (2000)-Maleimide (MW = 3000 g/mol) e adicionar a quantidade adequada de DMSO. Várias rodadas de vórtice suave e sonicação podem dissolvê-lo totalmente.
16. Determinar o volume total das fracções do passo 1.14 e transferir cuidadosamente a solução para um pequeno balão de fundo redondo (10-25 ml). Adicione a quantidade apropriada de 100x DSPE-PEG (2000) -Maleimide à proteína para obter um excesso molar de 1x 10 vezes na concentração final. Agite suavemente a solução para garantir que o DMSO esteja totalmente disperso.
17. Execute a reação durante a noite sob nitrogênio em um RBF selado. Use um septo de borracha e coloque-o em uma hotte.
    1. Remova a atmosfera perfurando o septo com uma agulha de 20 G conectada a uma seringa de 3 mL na extremidade do tubo conectado a um vácuo e ligue o vácuo por 3 a 5 s.
    2. Substitua a atmosfera por nitrogênio. Encha um balão preso a uma seringa de 3 ml cortada ao meio com nitrogênio e coloque uma agulha de 20 G. Perfurar o septo para encher a atmosfera no interior do balão redondo de fundo com azoto. Repita a remoção da atmosfera e a substituição por nitrogênio mais uma vez e deixe o balão de nitrogênio preso durante a noite.
18. Prepare uma coluna separada de esferas de gel de dextrano reticulado com uma faixa de fracionamento de 4.000 a 150.000 Da em uma coluna de cromatografia de vidro de 1,0 cm x 50 cm (conforme as etapas 1.1 a 1.3).
19. No dia seguinte, retirar a proteína do balão de fundo redondo preparado no passo 1.17 e passar (seguir o método utilizado no passo 1.6) sobre a coluna de esferas de gel de dextrano reticulado (do passo 1.18).
    NOTA: A quantidade total a ser carregada na coluna não deve ser superior a 2 mL. Se uma reação maior foi usada, divida em duas e execute em colunas separadas ou execute em uma coluna de diâmetro maior.
    1. Colete as frações, determine o A₂₈₀, as frações do topo do pool e determine a concentração de proteína. A presença do lipídio não afetará as medições.
20. Conservar as fracções finais agrupadas de proteínas lipídicas a 4 °C até estarem prontas a ser utilizadas.

2. Preparação de lipossomas

1. Pesar os lípidos: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000, MW = 2805,5 g/mol; Colesterol (3b-hidroxi-5-colesteroleno, 5-colesterol-3b-ol), MW = 386,7 g/mol; e DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), MW = 790,1 g/mol. Crie uma solução de 5 mg / mL de DSPC, 4 mg / mL de solução de colesterol e 2 mg / mL de solução de DSPE-PEG (2000) em clorofórmio.
2. Garantir que a razão molar de lipídios nos lipossomas seja: 57% DSPC, 38% Colesterol e 5% DSPE-PEG (2000), conforme representado na Tabela 1.
   NOTA: É importante controlar a quantidade de antígeno no lipossoma, que geralmente varia de 0,01 a 0,1%. Na Tabela 1, é utilizado 0,1% do fragmento IgM Fab anti-camundongo caprino ligado ao lipídio PEGilado. É fundamental levar em consideração o excesso molar de 10 vezes de DSPE-PEG (2000) -Maleimide que foi adicionado à proteína na etapa 1.15, para garantir que a quantidade total de lipídio PEGulado não exceda 5%.
3. Considere as quantidades lipídicas finais (μmol) ao criar lipídios para extrusão. Consulte a Tabela 1 para obter um exemplo de cálculo das concentrações de lipídios molares para a criação de lipossomas a uma concentração de lipídios totais de 1,25 μM.
4. Uma vez calculada a quantidade correta de cada lipídio a ser adicionado, combine tudo em um tubo de ensaio de vidro borossilicato de 12 mL.
5. Sopre cuidadosamente o clorofórmio.
   1. Use o tubo e uma seringa de 3 mL com uma agulha, preparada na etapa 1.17.1, para soprar cuidadosamente o clorofórmio no tubo com nitrogênio. Sopre suavemente um jato de nitrogênio na solução enquanto gira o tubo com a outra mão. Tenha cuidado para minimizar respingos ou fazer com que o líquido escorra pela lateral do tubo, pois pode ser mais difícil colocá-lo em solução na próxima etapa.
6. Adicione 100 μL de DMSO a cada tubo e liofilize esta solução durante a noite. Cubra a parte superior do tubo com um pano de laboratório não estático, prenda-o com um elástico e congele a -80 °C.

3. Extrusão de lipossomas

1. Adicione 1 mL de PBS contendo a proteína ligada a lipídios ao tubo de 12 mL contendo os lipídios. Sonicar a solução durante cerca de 30 segundos a 1 minuto em banho-maria de sonicação. Descanse por 5 minutos ou mais entre cada rodada e repita 3 a 4 vezes.
2. Prepare uma extrusora conforme indicado pelo fabricante.
   1. Adicione os suportes do filtro ao suporte da membrana interna e coloque algumas gotas (10 μL cada) de PBS no filme de parafina. Usando uma pinça, pegue uma borda do suporte do filtro e mergulhe-a na gota de 10 μL.
   2. Coloque o filtro dentro do O-ring. Faça isso para ambos os lados. Usando uma pinça, pegue um filtro de 0,8 μm na borda, mergulhe na gota de 10 μL e cubra a parte externa do O-ring com PBS. Coloque o filtro de 0.8 μm suavemente no O-ring para que o filtro não fique saliente no suporte interno da membrana.
3. Coloque o bloco de aquecimento da extrusora em uma placa quente para pré-aquecer a extrusora. Ligue a placa de aquecimento em baixa e deixe o bloco de aquecimento da extrusora atingir a temperatura desejada. Para evitar possíveis problemas com a agregação de proteínas, não aqueça o bloco além de 37 °C.
4. Carregue a amostra sonicada em uma das seringas de extrusão colocadas na extrusora. Coloque a seringa da extrusora na outra extremidade da extrusora. Certifique-se de que o êmbolo da seringa vazio esteja zerado. A seringa vazia será preenchida à medida que o lipídio for extrudado através da membrana de policarbonato de 0,8 μm. Tente evitar a passagem de bolhas para frente e para trás através da membrana.
5. Coloque a extrusora totalmente montada no bloco de aquecimento. Empurre suavemente o êmbolo da seringa cheia com lipídios para a seringa vazia. Dependendo da concentração de lipídios, isso será difícil de empurrar. Repita 20x.
6. Remova a extrusora totalmente montada do bloco de aquecimento. Remova lentamente a seringa cheia da extrusora, certifique-se de coletar quaisquer lipídios que possam vazar ao removê-la. Coloque os lipossomas em um frasco limpo. Repita as etapas 3.4 a 3.6 usando membranas de policarbonato de 0.2 μm e 0.1 μm.
7. Crie uma coluna de contas de agarose reticulada^{de 0,7} x 50 cm 2 com uma faixa de separação de 0,7-10 Mega Daltons (MDa) equilibrada em PBS. Adicione os lipossomas e execute como na etapa 1.6. Frações contendo lipossomas terão transmissão de luz diminuída na faixa de 250–400 nm.
8. Conservar os lipossomas a 4 °C e não congelar.

4. Fluxo de cálcio para monitorar a ativação de células B por lipossomas antigênicos

1. Eutanásia de camundongos por overdose de dióxido de carbono (CO₂) ou isoflurano, de acordo com os procedimentos operacionais padrão institucionais. Confirme a eutanásia de camundongos por luxação cervical.
2. Esterilizar os instrumentos cirúrgicos e a carcaça dos camundongos com etanol a 70%. Use uma pinça de íris curva de 10 cm de comprimento e ponta de 0,8 mm para separar a pele que cobre a cavidade torácica da caixa torácica. Use uma tesoura de dissecação reta de 10 cm de comprimento para fazer uma incisão distal com uma incisão bilateral.
3. Use uma pinça de íris curva e uma tesoura de dissecação para extrair o baço da cavidade abdominal. Remova o tecido adiposo ao redor do baço e coloque-o em um tubo cônico de poliestireno de 15 mL preenchido com RPMI1640 meio contendo 1% de soro fetal de bezerro (FCS) e penicilina-estreptomicina.
4. Transfira o baço e o meio sobre um filtro de células de 40 μm encaixado em um tubo cônico de 50 mL. Usando a extremidade de borracha de um êmbolo de seringa de 3 mL, esmague suavemente o baço. Lave o filtro de células de 40 μm com o meio. Repita este processo até que apenas o tecido adiposo seja deixado no filtro de células de 40 μm. Enxágue a peneira com 3-5 mL de meio para aumentar a recuperação celular.
5. Centrifugar o homogeneizado da célula a 300 x g durante 5 min à RT. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e adicione 10 mL de tampão de lise de 1x eritrócitos ao pellet. Pipete para cima e para baixo, deixe por 2–3 min em RT e depois centrifugue a 300 x g por 5 min em RT.
6. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os esplenócitos depletados de glóbulos vermelhos em 10 mL de meio. Determine o número total de células usando um hemocitômetro ou outro dispositivo de contagem de células. Pulverize as células por centrifugação conforme descrito acima.
   NOTA: A concentração final ideal necessária para o carregamento de esplenócitos Indo-1 é de 10 a 20 x 10⁶ células / mL, mas uma concentração mais baixa de células pode ser usada.
7. Ressuspenda os esplenócitos a 15 x 10⁶ células/mL em tampão de carga de fluxo de cálcio (Roswell Park Memorial Institute, RPMI1640 meio contendo 1% de FCS, 10mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES), cloreto de magnésio 1mM (MgCl₂), 1mM de etilenoglicol-bis(β-éter aminoetílico)-N, N,N', N'-ácido tetracético (EGTA) e 5% de penicilina-estreptomicina). Adicione 1,5 μM de Indo-1 de uma solução estoque de DMSO de 1 mM e inverta o tubo várias vezes para misturar. Proteger da luz e incubar as células em banho-maria a 37 °C durante 30 min.
8. Após a incubação de 30 minutos, adicione 5x a quantidade de tampão de carga de fluxo de cálcio. Centrifugue a 300 x g por 7 min em RT.
9. Para gating em células B, corar as células com 1:200 anti-camundongo CD5-PE e anti-camundongo 1:200 B220-PE/Cy7 em 0,5 mL de tampão de carga a 4 °C por 20 min, protegido da luz.
10. Lave os esplenócitos em tampão de carga de fluxo de cálcio e centrifugue a 300 x g por 7 min em RT. Ressuspenda as células a 10–20 x 10⁶ células/mL em tampão de fluxo de cálcio (solução salina balanceada de Hank (HBSS) contendo 1% de FCS, 1 mM de MgCl₂ e 1 mM de cloreto de cálcio (CaCl₂)). Armazenar no gelo, protegido da luz até que esteja pronto para funcionar com o citômetro de fluxo.
11. Configure a citometria de fluxo com controles de coloração única e não corada para compensação.
    1. Execute as células coradas para configurar os portões adequadamente (consulte a Figura 1A). Configure o gráfico Indo-1 (violeta) versus Indo-1 (azul), ajuste as tensões nos canais Indo-1 para colocar as células que estão sendo marcadas em uma inclinação de 45–60° para maximizar o sinal: relação ruído do Indo-1 violeta: mudança azul na proporção após estimulação de células B.
       NOTA: Certifique-se de que as tensões não sejam muito altas, de modo que uma porcentagem significativa das células (>5%) esteja no topo do gráfico.
    2. Crie uma porta diagonal que encapsule a parte superior esquerda (Violeta ⁺ Azul^-) do gráfico, de modo que, sem estimulação, <10% das células estejam na porta, que idealmente deve aumentar para >75% após a estimulação.
12. Adicione 0,5 mL de células a um tubo de poliestireno de fundo redondo de 5 mL tampado (tubo de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)) e aqueça as células a 37 ° C por 3 a 5 min em banho-maria. Coloque o tubo FACS na câmara com camisa de água a 37 °C conectada a um banho-maria de recirculação.
    1. Execute o tubo na camisa de água no citômetro de fluxo e inicie a aquisição, sem armazenar os dados, em aproximadamente 5.000–10.000 eventos/s. Depois que as células se estabilizarem (15 a 30 s), inicie a aquisição de dados e colete dados por pelo menos 10 s para estabelecer o plano de fundo.
    2. Na marca de 10 ranhos, remova rapidamente o tubo do citômetro de fluxo, adicione a estimulação (5-50 μM de lipossomas antigênicos em 2-20 μL), vórtice de pulso e retorne o tubo FACS ao citômetro de fluxo. Mantenha a aquisição e o armazenamento de dados durante esse tempo e colete dados por 3 a 5 minutos.
13. Analise os dados no software de análise apropriado sob as funções cinéticas.

Tabela 1: Cálculos para criar um lipossomo de concentração lipídica total de 1,25 μM.Exemplo de tabela de cálculo para lipossomas de fragmentos de IgM F(ab) de cabra anti-ratinho.

Mw	790	387	2900	3000	Nº 48000
	DSPC	colesterol	PEG-DSPE	excesso de PEG-DSPE	aIgM-PEG-DSPE	total
Razão molar	57	38	3.9	1	0,1	100,00
massa (mg)	0,56	0,18	0,14	0,04	0,06	0,98
mmol	0,71	0,47	0,05	0,01	0,00	1.25
Ml	112.50	45,93	70,64	0,00	525,97	755,03
			Conc. (mg/mL)
		DSPC	5
		colesterol	4
		PEG-DSPE	algarismo
		aIgM-PEG-DSPE	0,114

Resultados

Figura 1: Estratégia representativa de gating, resultados do fluxo de cálcio e análise.(A) As células foram analisadas através da seguinte estratégia de gating: linfócitos vivos (FSC-A vs. SSC-A), células únicas (FSC-W vs. SSC-W) e células B (B220 ⁺ CD5^-). (B) A resposta do fluxo Indo-1 / Ca²⁺ (violeta vs. a...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coletor de Frações Modelo 2110	BioRad	7318122
Colesterol	sigma	C8667	Grau Sigma 99%
SPDP	Thermo Fisher Científico	21857
DSPC	Avanti	850365
DSPE-PEG 18:0	Avanti	Rolamento 880120
DSPE-PEG Maleimide	Avanti	880126
Extrusora	Avanti	Nº 610000	Seringa de 1mL com suporte/bloco de aquecimento
Filtros 0,1 μm	Avanti	610005
Filtros 0,8 μm	Avanti	610009
Suportes de filtro de 10 mm	Avanti	6100014
Frasco de fundo redondo de vidro	sigma	Z100633
Rolhas de volume de negócios	Thermo Fisher Científico	Pág. 301398
tubulação	Thermo Fisher Científico	Pág. 198194
Bloqueio de Leur	Thermo Fisher Científico	K4201634503
Contas Sephadex G50	GE Ciências da Vida	17004201
Contas Sephadex G100	GE Ciências da Vida	17006001
Soro fetal inativado calor da vitela	Thermo Fisher Científico	10082147
HEPES (1M)	Thermo Fisher Científico	15630080
EGTA	sigma	E3889
Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Científico	15140122
1x tampão de lise de hemácias	Thermo Fisher Científico	00-4333-57
Indo-1	Invitrogen	I1203
CD5-PE	BioLegend	100608
B220-PE-Cy7	BioLegend	103222
HBSS	Thermo Fisher Científico	14170112	Sem cálcio e magnésio
MgCl2	sigma	M8266
CaCl2	sigma	C4901
IgM anti-mouse fabuloso	Jackson ImmunoResearch	115-007-020
F(ab')2 IgM anti-rato	Jackson ImmunoResearch	115-006-020