Concentração de proteína de filtrado de cultura bacteriana usando um dispositivo de ultrafiltração

Resumo

Fonte: Ryan, J. M., et al. Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de Vesículas Extracelulares por Cromatografia de Exclusão de Tamanho. J. Vis. Exp. (183) (2022)

Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de proteínas filtradas de cultura bacteriana, que incluem vesículas extracelulares bacterianas, usando ultrafiltração. As vesículas extracelulares concentradas servem como marcadores diagnósticos para a detecção de doenças.

Protocolo

1. Preparação do concentrado bruto de vesículas extracelulares (EV) de Mycobacterium tuberculosis (Mtb)

NOTA: Para procedimentos detalhados sobre o cultivo de Mtb e preparação de proteína filtrada de cultura (CFP). Recomenda-se que o meio de cultura bacteriano esteja livre de suplementos de crescimento com componentes proteicos ou contendo EV, como albumina oleica dextrose catalase (OADC) e detergentes como Tween. Recomenda-se também que a qualidade da cultura bacteriana e a CFP colhida sejam rastreadas para garantir a morte celular e a lise limitadas.

1. Prepare um filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (consulte a Tabela de Materiais) adicionando a capacidade de volume total de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS). Centrifugue por 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
   NOTA: Seestiver usando um filtro sem volume de parada morta, deve-se tomar cuidado para garantir que o sample volume não reduz abaixo do nível do filtro, resultando na secagem completa do filtro durante a centrifugação.
2. Rejeitar o escoamento e qualquer PBS restante antes de encher a câmara de recolha com Mtb CFP até à sua capacidade máxima. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C até que o volume tenha reduzido ao volume mínimo do dispositivo de ultrafiltração. Repita conforme necessário, adicionando mais CFP à unidade até que toda a amostra tenha sido reduzida o suficiente.
   nota: Retenha uma parte do material de fluxo contínuo de 100 kDa (100F) para qualificação a jusante, se desejar. Conservar a 4 °C.
3. Adicione 1x PBS à unidade de filtro que contém o concentrado até a capacidade total do dispositivo. Reduza o volume conforme descrito em 1.2. Repita esta etapa cinco vezes para garantir a lavagem completa e a troca do tampão.
4. Recupere o retentado concentrado de CFP de 100 kDa (100R) de acordo com as especificações do dispositivo de ultrafiltração (consulte a Tabela de Materiais). Assim que o 100R for recuperado, lave o filtro com um volume mínimo de 1x PBS pelo menos três vezes e agrupe a lavagem com o 100R para maximizar a recuperação.
5. Quantifique o material 100R com um ensaio bicinconínico (BCA) seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Para realizar o ensaio, use várias diluições de amostras 1:2, 1:5 e 1:10 em PBS. Teste a amostra em triplicado.
   nota: Retenha uma parte do material 100R para qualificação a jusante, se desejar. Conservar a 4 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Coletor automático de frações	Ciência IZON	AFC-V1-USD
Centricon Plus - Filtro centrífugo de 70, corte de 100 kDa	Millipore Sigma	UFC710008	Dispositivo de ultrafiltração usado na etapa 1.1
Solução salina tamponada com fosfato, 1X sem cálcio e magnésio	Corning	21-040-CV
Membrana de nitrocelulose, Rolo, 0,2 μm	BioRad	1620112