1. Preparação do concentrado bruto de Mtb EV
NOTA: Para procedimentos detalhados sobre o cultivo de Mtb e preparação de proteína filtrada de cultura (CFP), consulte Referências. Recomenda-se que o meio de cultura bacteriano esteja livre de suplementos de crescimento com componentes proteicos ou contendo EV, como albumina oleica dextrose catalase (OADC) e detergentes como Tween. Recomenda-se também que a qualidade da cultura bacteriana e a CFP colhida sejam rastreadas para garantir a morte celular e a lise limitadas.
- Prepare um filtro centrífugo de corte de peso molecular (MWCO) de 100 kDa (consulte a Tabela de Materiais) adicionando a capacidade de volume total de solução salina tamponada com fosfato (1x PBS). Centrifugue por 5 min a 2.800 x g a 4 °C.
nota: Se estiver usando um filtro sem volume de parada morta, deve-se tomar cuidado para garantir que o sample volume não reduza abaixo do nível do filtro, resultando em secagem completa do filtro durante a centrifugação.
- Rejeitar o escoamento e qualquer PBS restante antes de encher a câmara de recolha com Mtb CFP até à sua capacidade máxima. Centrifugar a 2.800 x g a 4 °C até que o volume tenha reduzido ao volume mínimo do dispositivo de ultrafiltração. Repita conforme necessário, adicionando mais CFP à unidade até que toda a amostra tenha sido reduzida o suficiente.
nota: Retenha uma parte do material de fluxo contínuo de 100 kDa (100F) para qualificação a jusante, se desejar. Conservar a 4 °C.
- Adicione 1x PBS à unidade de filtro que contém o concentrado até a capacidade total do dispositivo. Reduza o volume conforme descrito em 1.2. Repita esta etapa cinco vezes para garantir a lavagem completa e a troca do tampão.
- Recupere o retentado concentrado de CFP de 100 kDa (100R) de acordo com as especificações do dispositivo de ultrafiltração (consulte a Tabela de Materiais). Assim que o 100R for recuperado, lave o filtro com um volume mínimo de 1x PBS pelo menos três vezes e agrupe a lavagem com o 100R para maximizar a recuperação.
- Quantifique o material 100R com um ensaio bicinconínico (BCA) seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Para realizar o ensaio, use várias diluições de amostras 1:2, 1:5 e 1:10 em PBS. Teste a amostra em triplicado.
nota: Retenha uma parte do material 100R para qualificação a jusante, se desejar. Conservar a 4 °C.
2. Cromatografia de exclusão de tamanho para o enriquecimento de Mtb EV a partir de CFP
NOTA: O procedimento a seguir é específico para o uso de 3 mg de 100R Mtb CFP com coluna SEC e coletor automático de frações (AFC, consulte a Tabela de Materiais). Pode ser adaptado para outras concentrações iniciais e tipos de colunas, seguindo as especificações do fabricante. Além disso, recomenda-se que os usuários leiam e compreendam o manual do usuário do coletor automático de frações.
- Permita que a coluna SEC se equilibre à temperatura ambiente.
- Ligue o AFC usando o botão liga/desliga na parte traseira da unidade de torre e ajuste as configurações da célula de carga, se necessário, pressionando SETUP na tela sensível ao toque do menu principal. A célula de carga só deve ser calibrada no primeiro uso, após cada atualização de software e se for observada inconsistência nos volumes de coleta de frações.
- Na tela CONFIGURAÇÃO, alinhe o carrossel selecionando CARROSSEL > CALIBRAR. Insira o carrossel com os 13 pequenos orifícios voltados para cima na torre AFC e ajuste o carrossel de forma que o bico de fluido fique diretamente acima da posição nivelada pressionando os botões - e/ou +.
- Remova as tampas da coluna SEC equilibrada. Deslize a coluna SEC no suporte de coluna apropriado e instale-a cuidadosamente na torre AFC. Certifique-se de que a identificação por radiofrequência (RFID) tag na coluna esteja voltada para o AFC e verifique se a conexão entre a coluna e a válvula está segura. Coloque o tubo de saída de resíduos em um recipiente de coleta.
- Na tela CONFIGURAÇÃO, selecione Cronograma de coleta e defina a contagem para 13 e o tamanho para 0,5 mL pressionando os botões - e/ou +. Deixe a configuração "Volume do buffer" como padrão de 2.7 mL e, em seguida, feche a janela "Agendamento de coleta" pressionando X.
- Selecione INICIAR COLETA na tela inicial e confirme os parâmetros de coleta selecionando SIM. Carregue 13 tubos de microcentrífuga de 1,7 mL rotulados com as tampas abertas e apontando para o centro do carrossel.
- Avance o AFC selecionando OK, monte o reservatório da coluna e avance novamente pressionando OK. Selecione a opção para liberar a coluna pressionando SIM e adicione um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 μm para remover qualquer buffer de armazenamento. Quando a descarga estiver concluída, avance o AFC pressionando OK.
- Coloque a tampa do carrossel sobre o AFC e pressione OK. Prepare um volume de coluna de PBS filtrado de 0,2 μm. Use uma pipeta para remover qualquer excesso de buffer da coluna.
- Traga 3 mg de amostra 100R conforme quantificado na etapa 1,5 a 500 μL com 1x PBS. Adicione a amostra de 3 mg ao topo da coluna. Avance o AFC e deixe a amostra escorrer para a frita. Uma vez que a amostra tenha entrado totalmente na coluna, adicione o PBS preparado na etapa 2.6 ao reservatório.
- Monitore a execução do AFC enquanto ele coleta primeiro o volume vazio e, em seguida, as frações especificadas. Após a conclusão da corrida e o carrossel retornar à posição de resíduos, remova a tampa e remova os tubos de fração do carrossel. Armazenar as fracções a 4 °C antes da quantificação (etapa 3) e da qualificação (etapa 4).
- Se a coluna for reutilizada, selecione a opção para limpar a coluna pressionando SIM; caso contrário, pressione NÃO. Siga as instruções no AFC.
NOTA: Uma vez lavada a coluna e o tampão de armazenamento, pode ser removido, tampado e armazenado a 4 °C.