Uma técnica para quantificar a infecção fúngica em larvas de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Thrikawala, S., et al. Infecção de larvas de peixe-zebra com esporos de Aspergillus para análise de interações patógeno-hospedeiro. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra um método para quantificar a infecção fúngica em larvas de peixe-zebra. Os esporos de fungos são microinjetados no ventrículo larval do rombencéfalo e as larvas são incubadas para permitir o desenvolvimento da infecção. As larvas infectadas são colhidas em intervalos definidos e o progresso da infecção é avaliado pela enumeração das unidades formadoras de colônias.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de esporos de Aspergillus para injeção

1. A partir de uma suspensão de esporos de Aspergillus, calcule o volume necessário para obter 1 x 10⁶ esporos. O volume deve ser de 20–100 μL; caso contrário, produza uma diluição de 10x em Tween-20 estéril a 0,01% (v/v) (Tween-water; Tabela de Materiais). Por exemplo, se o volume calculado for de 5 μL, produza uma diluição de 10x e use 50 μL da solução diluída.
   nota: Duas placas/cepas podem ser preparadas para coletar mais esporos ou como sobressalentes em caso de contaminação.
2. Espalhe 1 x 10⁶ esporos de Aspergillus em uma placa de mídia mínima de glicose (GMM) (Tabela de Materiais) com um espalhador descartável estéril em forma de L em um gabinete de biossegurança. Evite espalhar para a margem da placa. Incubar a 37 °C durante 3-4 dias, com a placa virada para baixo.
3. No dia da coleta, leve miracloth estéril e tubos cônicos de 50 mL (dois por cepa), frascos frescos de água Tween estéril (um por cepa) e espalhadores descartáveis estéreis em forma de L para o gabinete de biossegurança.
   nota: Miracloth pode ser cortado em ~ 8 pol x 6 em pedaços, embrulhado em papel alumínio e autoclavado para esterilizar.
4. Coloque um pedaço de pano de mira em cada tubo cônico de 50 mL rotulado e tampe novamente. Retire o pacote de miracloth restante do capô.
5. Traga as placas para o gabinete de biossegurança. Abra um prato e despeje água de interpolação na parte superior para cobrir cerca de três quartos do prato.
6. Usando um espalhador descartável em forma de L, raspe suavemente a superfície da cultura fúngica em um movimento para frente e para trás, enquanto usa a outra mão para girar a placa. Raspe até que quase todos os esporos estejam homogeneizados na água Tween.
   nota: Devido à alta hidrofobicidade, os esporos podem criar "sopros" quando a água Tween é adicionada ou durante a raspagem. Deve-se tomar muito cuidado para evitar a contaminação de tubos ou placas próximas. É aconselhável trocar as luvas e limpar a superfície com etanol a 70% entre a extração de diferentes cepas.
7. Pegue um tubo cônico de 50 mL e remova o pedaço de miracloth. Dobre-o ao meio e transforme-o em um filtro inserido na parte superior do tubo cônico de 50 mL.
8. Despeje o homogeneizado fúngico da placa sobre o miracloth no tubo.
   nota: Se duas placas de uma cepa forem preparadas, raspe as duas placas e despeje-as no mesmo tubo cônico.
9. Despeje água Tween para trazer o volume total no tubo cônico para 50 mL.
10. Gire a 900 x g por 10 min. Certifique-se de usar tampas anti-aerossolização na centrífuga.
11. Despeje o sobrenadante em uma solução de alvejante de ~ 10% para descontaminar. Despeje 50 mL de 1x PBS estéril no tubo cônico e, em seguida, agite ou agite para ressuspender o pellet.
12. Gire novamente a 900 x g por 10 min. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 5 mL de PBS 1x estéril. Filtre através de um novo pedaço de miracloth em um tubo cônico novo de 50 mL.
13. Faça diluições seriadas de 10 vezes (10x, 100x, 1000x) do homogenato fúngico em tubos de centrífuga de 1,7 mL (por exemplo, para a solução 10x, misture 100 μL do homogenato fúngico com 900 μL de água Tween).
14. Escolha a primeira diluição em que os esporos não são visíveis quando são descarregados na água de interpolação e use essa diluição para contar o número de esporos usando um hemocitômetro.
15. Calcular a concentração de esporos no homogeneizado fúngico preparado (suspensão aquosa) utilizando a seguinte fórmula:
    Concentração (esporos/ml) = Número de esporos nas caixas médias 25 x factor de diluição x 10⁴
16. Prepare um estoque de 1 mL de 1,5 x 10⁸ esporos / mL em 1x PBS estéril em um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Esta preparação de esporos pode ser armazenada a 4 °C durante ~4 semanas.
17. Antes de usar em injeções, misture 20 μL da preparação de esporos com 10 μL de vermelho de fenol estéril a 1% em um tubo de centrífuga de 1,7 mL para atingir uma concentração final de esporos de 1 x 10⁸ esporos / mL. Vórtice completamente antes da injeção.
    NOTA: A solução de vermelho de fenol a 1% deve ser esterilizada por filtro e armazenada em alíquotas.
18. Para uma injeção simulada, misture 20 μL de 1x PBS com 10 μL de vermelho de fenol estéril a 1%.

2. Preparação de placas de ágar para injeção

1. Prepare 2% de agarose em meio E3 e derreta no micro-ondas.
2. Despeje em uma placa de Petri de 100 mm x 15 mm (~ 25 mL por placa), gire para cobrir a placa uniformemente e deixe esfriar.
3. Envolver a placa com película de parafina e conservar invertida a 4 °C.
4. Antes da injeção, leve a placa à temperatura ambiente (RT).
5. Despeje ~ 1 mL de albumina de soro bovino a 2% (BSA) esterilizada por filtro na placa, incline a placa para espalhar e cobrir todo o fundo e enxágue com E3.
   NOTA: A solução de BSA a 2% pode ser esterilizada por filtro e armazenada como alíquotas de 1 mL a -20 °C. O pré-tratamento com BSA a 2% evita que as larvas grudem na superfície da agarose.
6. Despeje E3 com tricaína tamponada na placa e deixe descansar até a injeção.

3. Microinjeção de ventrículo posterior de larva de peixe-zebra

1. Descorionar manualmente larvas com fórceps aos 2 dias pós-fertilização (dpf) em placa de Petri.
   nota: A descorionação pode ser realizada a qualquer momento a partir de 1,5 dpf até o momento da injeção.
2. Remova o máximo possível de E3 da placa de Petri e adicione 300 μg/mL de tricaína tamponada em E3 para anestesiar as larvas.
   nota: Pode preparar-se uma solução-mãe de 4 mg/ml de tricaína tamponada em E3 e conservá-la a 4 °C. A solução de trabalho pode ser feita diluindo 4 mL da solução estoque até 50 mL com E3.
3. Use uma configuração de microinjeção fornecida com o injetor de pressão, unidade de contrapressão, pedal, suporte de micropipeta, micromanipulador e um suporte e placa magnéticos, todos conectados a uma fonte de ar comprimido (Tabela de Materiais).
4. Abra a válvula de ar comprimido e ligue o microinjetor. Defina a pressão para ~25 PSI, a duração do pulso para 60 ms e a unidade de contrapressão para 1 PSI.
5. Carregue uma agulha de microinjeção usando uma ponta de pipeta de microcarregador (Tabela de Materiais) com cerca de 3–5 μL de PBS preparado ou suspensão de esporos com vermelho de fenol. Monte a agulha no micromanipulador.
   nota: As agulhas de microinjeção podem ser preparadas conforme descrito anteriormente. O microscópio estéreo usado para microinjeções deve ter um retículo ocular para calibrar a agulha de microinjeção. O retículo deve ser calibrado com um micrômetro de estágio e o comprimento da escala do retículo (μm) deve ser determinado. O diâmetro da gota de suspensão de esporos que é ejetada da agulha é medido dependendo do número de hashes (do retículo) que se sobrepõem à gota.
6. Posicione o micromanipulador de forma que a extremidade da agulha fique à vista na menor ampliação sob o microscópio estéreo. Zoom para ampliação de 4x, mantendo a agulha à vista.
7. Usando uma pinça afiada, prenda a ponta da agulha. Pressione o pedal de injeção para visualizar o tamanho da gota que sai. Continue cortando até que ~ 3 nL de suspensão de esporos seja injetado (aqui, são cinco hashes).
8. Mova o micromanipulador e a agulha para fora do caminho para evitar bater acidentalmente na agulha enquanto as larvas estão dispostas na placa de injeção.
9. Despeje E3-Tricaine fora da placa de injeção e, em seguida, transfira ~ 24 larvas anestesiadas para a placa de injeção com o mínimo de E3 possível usando uma pipeta de transferência.
10. Usando uma pequena ferramenta para manipular larvas de peixe-zebra (ou seja, ferramenta de laço de cabelo ou ferramenta de cílios), organize as larvas de acordo com a direção para a qual estão voltadas. Especificamente, coloque todos voltados para a direita em uma linha e todos voltados para a esquerda em uma linha abaixo.
    nota: Esse arranjo é difícil se houver muito líquido na placa, pois as larvas "flutuam" para fora do lugar. No entanto, muito pouco líquido também é problemático se as injeções demorarem muito, pois as larvas podem secar ou a anestesia passar. Assim, deve-se prestar muita atenção à quantidade de líquido na placa durante todo o processo de microinjeção.
11. Ajuste o zoom do microscópio para a ampliação mais baixa. Traga o micromanipulador de volta e arrume-o de forma que a agulha fique perto das larvas, em um ângulo de ~ 30 ° a 60 °, no meio do campo de view.
12. Aumente o zoom para a ampliação mais alta e use os botões de ajuste fino para ajustar ainda mais a posição da agulha. Verifique se ~ 30–70 esporos estão saindo da agulha injetando a suspensão de esporos no líquido na placa ao lado das larvas. Ajuste o tempo e a pressão na configuração da injeção, se necessário.
    nota: Este teste deve ser repetido a cada cinco a seis larvas, pois o número de esporos que saem da agulha pode aumentar ou diminuir com o tempo.
13. Começando com a linha em que as larvas estão voltadas para a agulha, mova a placa de forma que a agulha fique diretamente acima e posicionada perto das primeiras larvas.
14. Movendo a agulha com o micromanipulador, insira a agulha através do tecido ao redor da vesícula ótica para perfurar o ventrículo do rombencéfalo. Mova a placa com a outra mão conforme necessário para obter a orientação correta da larva com o ângulo da agulha.
15. Verifique visualmente se a extremidade da agulha está no centro do ventrículo do rombencéfalo, pressione o pedal para injetar esporos e retraia suavemente a agulha.
    nota: O corante vermelho de fenol deve permanecer principalmente dentro do ventrículo do rombencéfalo. Uma pequena quantidade pode ir para o mesencéfalo, mas não deve atingir o prosencéfalo ou fora do cérebro. Se isso acontecer, o volume que está sendo injetado é muito grande e a pressão e o tempo devem ser diminuídos de acordo, ou uma nova agulha deve ser calibrada.
16. Descendo a placa, injete todas as larvas nessa fileira. Em seguida, vire a placa e injete todas as larvas na outra linha.
    nota: As larvas injetadas sem sucesso ou danificadas acidentalmente podem ser marcadas por 1) injetar na gema algumas vezes para criar uma marca vermelha ou 2) arrastar a larva para fora da linha com a agulha.
17. Mova a agulha para cima e para fora do caminho novamente. Diminua o zoom para uma ampliação menor no microscópio. O corante vermelho de fenol ainda deve ser visível no rombencéfalo de cada larva.
18. Primeiro, afaste-se com uma ferramenta de laço de cabelo e pipete para descartar todas as larvas com injeções malsucedidas. Transfira as larvas restantes para uma nova placa de Petri, lavando-as da placa com E3 estéril fresco e uma pipeta de transferência.
19. Repita conforme necessário para o número de amostra experimental final desejado.
20. Enxágue as larvas pelo menos 2x com E3 e garanta a recuperação da anestesia.
21. Para quantificar a sobrevivência sem qualquer tratamento adicional, usando uma pipeta de transferência, transfira as larvas para uma placa de 96 poços (1 larva por poço) em E3.

4. Estabelecimento do número de esporos injetados e viáveis

1. Imediatamente após a injeção, usando uma pipeta de transferência, pegue aleatoriamente cerca de oito das larvas injetadas e transfira-as para tubos de centrífuga de 1,7 mL (uma larva por tubo).
2. Eutanasiar as larvas com tricaína ou colocando-as a 4 ° C por 0,5–2,0 h.
3. Prepare 1 mL de 1 mg/mL de ampicilina e 0,5 mg/mL de soluções antibióticas de canamicina em PBS 1x estéril. A solução restante pode ser armazenada a 4 °C e usada posteriormente.
   nota: As soluções de estoque de ampicilina a 100 mg/mL e canamicina a 50 mg/mL podem ser pré-fabricadas, esterilizadas por filtro e armazenadas em alíquotas a -20 °C. Dilua estes 100x em 1x PBS para obter a solução de trabalho.
4. Usando uma pipeta, remova o máximo de líquido possível do tubo da centrífuga, deixando a larva para trás, e adicione 90 μL do PBS 1x com antibióticos.
   nota: Os antibióticos são usados para prevenir o crescimento bacteriano em placas GMM que podem interferir na contagem de colônias de Aspergillus.
5. Homogeneizar as larvas em um lisador de tecido a 1.800 oscilações/min (30 Hz) por 6 min. Girar a 17.000 x g por 30 s.
6. Rotular placas GMM (uma placa por larva homogeneizada). Usando um bico de Bunsen para criar um ambiente estéril, pipete a suspensão homogeneizada de um tubo até o meio da placa GMM e, em seguida, espalhe usando um espalhador descartável em forma de L. Evite espalhar o homogeneizado contra a borda.
7. Incubar as placas de cabeça para baixo a 37 °C durante 2 a 3 dias e contar o número de colónias formadas (UFC).
8. Para medir o número de esporos vivos durante o período de infecção, pegue as larvas das placas de 96 poços de 1 a 7 dias após a injeção (dpi) e transfira-as para tubos de centrífuga. Eutanasiar e homogeneizar as larvas para se espalharem em placas GMM, conforme descrito nas etapas 4.1 a 4.5.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fórceps Dumont #5	Roboz Instrumento Cirúrgico Co.	RS-5045
Retículo da ocular	Mundo do Microscópio	RETR10	Para calibrar agulhas, usadas em estereomicroscópio
Configuração do microinjetor: Unidade de contrapressão	Instrumentação Científica Aplicada	BPU
Pedal	Instrumentação Científica Aplicada	FTSW
Kit de suporte de micropipeta	Instrumentação Científica Aplicada	M-Pip
Injetor de pressão	Instrumentação Científica Aplicada	MPPI-3
Configuração do micromanipulador: Micromanipulador	Narashige (Tritech)	M-152
Suporte e placa magnéticos	Tritech	MINJ-HBMB
Extrator de agulhas	Instrumento Sutter	Pág. 97
Estereomicroscópio	Nikon	SMZ-745
Tissuelyser II	Qiagen	Rolamento 85300	Para homogeneizar larvas
material
agarose	pescador	BP160-500
Sal de ampicilina sódica	pescador	AAJ6380706
BSA, fração V	VWR	AAJ65855-22
Sulfato de canamicina	pescador	AAJ1792406
L espalhadores	pescador	14 665 230
Agulhas microcapilares (sem filamento)	Instrumentos de Precisão Mundial (WPI)	TW100-3
Pontas de pipeta de microcarregadeira	VWR	89009-310	Para carregar a agulha com suspensão Aspergillus
Miracloth	VWR	EM475855-1R	Para filtrar a suspensão do Aspergillus
N-feniltioureia	pescador	AAL0669009	Para evitar a pigmentação
Vermelho de fenol, solução a 1%	pescador	Rolamento 57254
Tricaína (3-aminobenzoato de etilo, sal de ácido metanossulfónico)	pescador	AC118000500	Para anestesiar larvas
Interpolação-20	pescador	BP337-500
Mídia e Soluções			Componentes/Receita
Mídia E3: 60x E3			17,2 g de NaCl, 0,76 g de KCl, 2,9 g de CaCl2, 4,9 g de MgSO4 · 7H2O, a 1 L com H2O
1x E3			16,7 ml de estoque 60x, 430 ul 0,05 M NaOH, a 1 L com H2O (opcional: + 3 ml de azul de metileno a 0,01%)
Solução-mãe de tricaína			2 g de tricaína, 5 g de Na2HPO4 · 7H2O, 4,2 ml 60X E3, a 500 ml com H2O, pH a 7,0-7,5 com NaOH
Ágar de meio mínimo de glicose (GMM): ágar GMM			10 g de glicose (dextrose), 50 ml 20x sais de nitrato, 1 ml TE, a 1 L com H2O, pH a 6,5 com NaOH, + 16 g de ágar, autoclave
20x sais de nitrato			120 g NaNO3, 10,4 g KCl, 10,4 g, MgSO4 · 7H2O, 30,4 g, KH2PO4, a 1 L com H2O, autoclave
Oligoelementos (TE)			2,20 g ZnSO4 · 7H2O, 1,10 g H3BO3, 0,50 g MnCl2 · 4H2O, 0,16 g FeSO4 · 7H2O, 0,16 g CoCl2 · 6H2O, 0,16 g CuSO4 · 5H2O, 0,11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5,00 g de Na2EDTA, a 100 ml com H2O, dissolver agitando durante a noite, autoclave