A técnica de fotoconversão para explorar a dinâmica celular inflamatória em pupas de insetos

Abstract

Fonte: Weavers, H. et al., Rastreamento in vivo de longo prazo da dinâmica celular inflamatória em pupas de Drosophila.J. Vis. Exp. (2018)

O vídeo demonstra o uso da fotoconversão para estudar a dinâmica das células inflamatórias em pupas de Drosophila. Os hemócitos verdes são atraídos para o epitélio ferido, seguidos por migração distante. A fotoconversão muda certos hemócitos de verde para vermelho, facilitando o rastreamento de seus movimentos.

Protocol

Este protocolo consiste em quatro etapas sequenciais principais: (1) Preparação de estoques de Drosophila e estadiamento de pupas de Drosophila, (2) Dissecção e montagem de pupas, (3) Ferimento de pupas, (4) imagens confocais de lapso de tempo in vivo.

1. Preparação de estoques de Drosophila e estadiamento de pupas

1. Obtenha estoques apropriados de Drosophila (ver Introdução e Tabela de Materiais).
2. Colete moscas adultas jovens e saudáveis com o genótipo apropriado.
   1. Selecione moscas adultas usando almofadas de gás dióxido de carbono para anestesiar brevemente as moscas e um pincel fino para transferir moscas do genótipo ou gênero apropriado para um frasco de coleta.
   2. Adicione 20 fêmeas virgens e 20 machos a cada frasco contendo meio alimentar padrão para moscas (uma mistura de fubá, melaço e ágar, consulte a Tabela de Materiais) suplementado com fermento.
3. Para uma geração ideal de pupas, coloque as moscas adultas todos os dias em novos alimentos em frascos frescos, mantendo todos os frascos a 25 °C.
   nota: Se o sistema de sequência de ativação Gal4-upstream (Gal4-UAS) estiver sendo usado para conduzir a expressão gênica específica da linhagem, todas as etapas devem ser executadas a 25 ° C ou mais, pois o sistema Gal4-UAS é sensível à temperatura.
4. 18 h antes da sessão de imagem agendada, selecione pelo menos 10 pré-pupas brancas recém-formadas (Figura 1A) dos frascos (ou seja, 0 h após a formação do pupário, APF) usando uma pinça ou um pincel fino para desalojar as pupas da superfície interna do frasco e transfira as pupas cuidadosamente para o lado de um frasco plástico vazio limpo.
   nota: As larvas errantes de^3º ínstar rastejam para cima para fora do meio alimentar para sofrer pupação; As pré-pupas brancas recém-formadas são facilmente identificadas, pois possuem espiráculos anteriores evertidos e são estacionárias (ao contrário das larvas de^3º ínstar). A cutícula se transforma no 'pupário' (a caixa de pupa), que é inicialmente macia e branca. Deve-se tomar cuidado para evitar danificar as pupas, pois isso pode levar não apenas a uma resposta inflamatória induzida por lesão indesejada, mas também a um atraso significativo no desenvolvimento.
5. Envelheça as pupas selecionadas para o estágio de desenvolvimento apropriado (18 h APF dará ótimos resultados) no frasco a 25 ° C.
   nota: À medida que as pupas se desenvolvem, a caixa da pupa se torna progressivamente mais escura e quebradiça.
6. Prepare outros reagentes para a próxima etapa com antecedência. Para fazer a cola de heptano, combine um comprimento de 20 cm de fita dupla face enrolada com 20 mL de heptano em um tubo de centrífuga de 50 mL, sele com o filme de parafina e balance em temperatura ambiente durante a noite na bancada.

2. Preparação e dissecção de pupas de Drosophila

1. Transfira as pupas de Drosophila encenadas para um pedaço de fita adesiva dupla face montada em uma lâmina de vidro. Posicione as pupas de forma que o lado ventral fique firmemente preso à fita e o lado dorsal voltado para cima (Figura 1B).
   nota: A parte anterior da pupa será identificável a partir dos dois espiráculos que se projetam da extremidade anterior da caixa da pupa.
2. Remova cuidadosamente as pupas de seu invólucro protetor de pupário sob um microscópio de dissecção de campo claro usando fórceps e microtesouras (Figura 1B-D).
   1. Inicialmente, faça uma incisão na região mais anterior do pupário usando a pinça (Figura 1B). Certifique-se de que a caixa de pupa nesta área seja oca e desprovida de tecido pupal, pois as pupas terão encolhido dentro da caixa durante o desenvolvimento inicial da pupa.
   2. Após esta incisão inicial, rasgue ou corte cuidadosamente a caixa da pupa aberta na direção anterior-posterior usando uma pinça ou microtesoura (Figura 1C) até que a pupa esteja completamente livre do invólucro marrom opaco quebradiço (Figura 1D).
      nota: As pupas nesta fase são muito frágeis e deve-se tomar cuidado para evitar perfurar a superfície da pupa; A punção é óbvia, pois a hemolinfa vaza rapidamente do local da punção. Pupas com perfurações, por menores que sejam, devem ser descartadas.
3. Monte as pupas em um prato com fundo de vidro usando cola de heptano.
   1. Use uma ponta de pipeta de 20 mL para colocar uma gota de 10 mL de cola de heptano pré-preparada (consulte a seção 1.6 acima) em uma linha no prato com fundo de vidro.
   2. Deixe a cola secar por 5 s antes de transferir as pupas dissecadas cuidadosamente para a cola de heptano usando uma pinça (Figura 1E).
   3. Para facilitar a lesão e a imagem, alinhe as pupas em uma fileira; aproximadamente 5 pupas são sugeridas, mas mais serão gerenciáveis com a experiência.
      nota: O uso de cola de heptano é recomendado ao usar sistemas de imagem verticais, mas não é necessário ao usar um sistema invertido. Se a cola criar aberrações ópticas durante a imagem, as pupas podem ser colocadas diretamente na lamínula – a adesão natural entre o tecido da pupa e o vidro será suficiente na maioria dos casos para uma imagem estável, desde que seja tomado cuidado ao mover a placa de imagem entre os microscópios.
4. Para obter melhores resultados, monte as pupas de forma que a asa fique plana na lamínula com a maior parte da superfície da asa em contato direto com a lamínula (Figura 1F). Role as pupas usando uma pinça para mudar sua posição para garantir que a asa esteja montada corretamente.
5. Para evitar a desidratação da amostra durante o período de imagem, adicione um pedaço de papel de filtro absorvente embebido em água destilada na lateral do prato com fundo de vidro no final da montagem, tomando cuidado para não perturbar as pupas (Figura 1E). Cubra o prato com uma tampa.
   nota: As pupas agora estão prontas para serem feridas e fotografadas.

3. Ferimento induzido por laser de asas de pupa de Drosophila

1. Transfira o prato com fundo de vidro contendo as pupas montadas para um microscópio de campo amplo equipado com um sistema de ablação a laser sintonizável.
   1. Use um laser de ablação bombeado por nitrogênio refrigerado a ar UV pulsado sintonizado para 435 nm - consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes; o comprimento de onda preciso da luz usada para iluminação é selecionado pelo usuário por meio de uma célula de corante apropriada.
2. Usando óptica de campo claro, ajuste os controles do estágio do microscópio para localizar a asa da pupa da primeira pupa a ser ferida (Figura 1F).
3. Para obter os melhores resultados, use uma lente objetiva de imersão em óleo 40X ou 63X para a imagem e a ablação a laser; certifique-se de que o líquido de imersão usado (óleo ou glicerol) seja consistente entre os sistemas de ablação e imagem. Ajuste o microscópio para focar no plano do epitélio da asa de pupa mais próximo da lamínula de vidro (ou seja, focar na região do epitélio a ser ferido) usando o botão de controle de foco fino.
4. Usando os ajustes do estágio do microscópio, posicione a asa da pupa de forma que a área a ser ferida fique diretamente alinhada com a área-alvo conhecida do laser de ablação.
5. Use uma lâmina atenuadora de densidade de energia instalada no microscópio para ajustar manualmente o nível de potência da luz de ablação.
   nota: O controle deslizante do atenuador tem paradas de clique e réguas para identificar o nível relativo de atenuação e permitir o uso de configurações reproduzíveis.
6. Usando um controle de gatilho manual externo, ative o laser de ablação usando um único clique breve do gatilho para fazer uma ferida. Verifique o aparecimento da bolha de ar transitória no local da ablação, pois o ferimento normalmente será acompanhado por ela. Verifique se o ferimento induzido pelo laser foi bem-sucedido usando os filtros fluorescentes apropriados para visualizar o epitélio pupal.
   nota: Tome cuidado para evitar a exposição acidental aos feixes de laser, pois os reflexos do feixe podem causar danos graves aos olhos ou à pele.
7. Se o ferimento não for bem-sucedido, varie o plano focal (movendo o foco do microscópio ligeiramente acima ou abaixo do nível focal atual) e repita o clique único do gatilho de ablação. Como alternativa, aumente gradualmente a potência do laser usando a lâmina atenuadora até atingir o tamanho desejado da ferida.
8. Para variar a taxa de repetição do pulso do laser de ablação, use o botão Taxa de repetição no painel de controle traseiro (que altera a taxa de menos de 1 pulso/s até 60 Hz). Para um ferimento ideal, defina a taxa de repetição de pulso para 40 Hz.
9. Para gerar feridas de tamanhos diferentes, use a corrediça atenuadora de densidade de energia para ajustar manualmente o nível de potência da luz de ablação.
10. Evite ferir todas as pupas montadas e use essas pupas não abladas como controles não feridos.
11. Para resultados consistentes, realinhe regularmente o sistema de ablação (usando o manual de operação relevante). Além disso, limpe e reabasteça a célula ressonadora de corante que controla o comprimento de onda de saída do laser.

4. Imagem confocal com lapso de tempo in vivo

1. Transfira rapidamente a placa com fundo de vidro para um microscópio apropriado para imagens de lapso de tempo.
   nota: Para obter os melhores resultados, use um microscópio confocal ou de disco giratório de alta especificação equipado com detectores sensíveis que podem detectar a proteína fluorescente verde (GFP) e os fluoróforos mCherry.
2. Para obter imagens de toda a asa da pupa, use uma lente objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 20X) (Figura 2A). Para obter imagens do reparo da ferida e da resposta inflamatória que o acompanha com alta resolução espacial, use as lentes objetivas de imersão em óleo 40X (NA 1.3) ou 63X (NA 1.4) (veja as imagens representativas na Figura 2B-D).
3. Abra o software de captura de imagem apropriado associado ao microscópio.
4. Usando o software de captura de imagem, ligue os lasers apropriados, por exemplo, os lasers de 488 nm e 561 nm para visualizar fluoróforos GFP e mCherry, respectivamente (clicando nas caixas relevantes) e ajuste a potência do laser e as configurações de ganho/deslocamento para fornecer sinal fluorescente suficiente, evitando a saturação de pixels; use a menor potência de laser possível (na faixa de 5 a 20%) para minimizar o fotobranqueamento e a fototoxicidade.
5. Para capturar o epitélio reparador e o recrutamento de células inflamatórias, configure o microscópio para registrar uma pilha z usando os botões de ajuste de foco fino no painel de controle; para obter os melhores resultados, configure o software (usando cliques manuais de botão) para registrar fatias z através da asa da pupa (mínimo a cada 3 mm), do topo do epitélio ferido até o espaço extracelular abaixo (contendo hemócitos migratórios) para obter uma grande pilha z (na faixa de 50 a 100 mm).
6. Para imagens de lapso de tempo, registre z-stacks em intervalos de tempo regulares (mínimo a cada 30 s) por pelo menos 1 h após o ferimento.
   nota: O intervalo de tempo exato entre as pilhas z escolhidas representa uma troca entre capturar a dinâmica celular em rápida mudança e evitar o fotobranqueamento das amostras.
7. Para obter imagens simultâneas de várias pupas (incluindo controles não feridos não ablacionados), use uma platina motorizada (conectada ao microscópio) e o recurso de aquisição de várias posições disponível no software de imagem. Defina manualmente a posição de cada pupa dentro do software usando os botões de controle de posição do estágio e, em seguida, defina manualmente os limites apropriados da pilha z (superior e inferior) para cada pupa.
8. Visualize as imagens de lapso de tempo durante a captura de imagem ou posteriormente com software de análise de imagem especializado (como o ImageJ) usando projeções z-stack ou renderização 3D. Por exemplo, para acompanhar os movimentos de hemócitos individuais (como na Figura 2C 'e D'), rastreie os núcleos dos hemócitos usando os plug-ins ImageJ de acesso aberto "TrackMate" ou "Manual Tracking" (métodos publicados em).
9. Use sondas fotoconversíveis (como Kaede) para fotoconverter seletivamente e rotular um subconjunto de células epiteliais ou imunes durante a imagem.
   1. Abra os módulos apropriados dentro do software de imagem para realizar a fotoconversão (como o módulo de recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP) e recuperação de fluorescência após fotobranqueamento) e ative o laser de 405 nm (clicando na caixa de software relevante).
   2. Selecione as células a serem fotoconvertidas no software FRAP usando a ferramenta de seleção quadrada, circular ou à mão livre. No software FRAP, defina o curso de tempo para fotoconversão (branqueamento) para uma única iteração/quadro e defina o laser de 405 nm com 20% da potência do laser. Clique manualmente em Iniciar o experimento para realizar a fotoconversão.
   3. Saia do módulo FRAP (clique em Fechar) e retorne à tela de imagem original dentro do software; use os lasers de 488 nm e 561 nm para obter imagens do comportamento de células fotoconvertidas e não fotoconvertidas, configurando uma pilha z e gravação de lapso de tempo como acima.
      nota: As sondas fotoconvertidas permanecem estáveis por muitas horas após a fotoconversão inicial, permitindo que o comportamento das células fotoconvertidas seja acompanhado ao longo do tempo (por pelo menos 5 h). Por exemplo, as células inflamatórias na ferida podem ser fotoconvertidas seletivamente ( Figura 2F ) e seu comportamento seguido à medida que se resolvem a partir do local da lesão ( Figura 2G e H ).

Results

Figura 1: Preparação de pupa de Drosophila para ferimento e imagem ao vivo. (A) Pré-pupas brancas de Drosophila coletadas em 0 h APF, com a extremidade anterior indicada por apêndices respiratórios evertidos (espiráculos). (B) Depois de criar pré-pupas brancas de 0h APF por 18 h a 25 ° C, o pupário parece marrom. A dissecção da caixa de pupa deve co...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Estoques de Drosophila
E-caderina onipresente marcada com GFP; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)	Centro de Estoque de Kyoto, DGRC	#109007	As sequências promotoras Ubi-p63E conduzem a expressão de Drosophila E-caderina (espingarda) marcada na extremidade C-terminal com GFP.
E-caderina onipresente marcada com GFP;; Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (Universidade de Indiana)	#58742	As sequências promotoras Ubi-p63E conduzem a expressão de Drosophila E-caderina (espingarda) marcada na extremidade C-terminal com GFP.
Onipresente Moesin P {sGMCA} 3.1 com a marca GFP	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (Universidade de Indiana)	#59023	O promotor / intensificador sqh expresso de forma onipresente impulsiona a expressão de um fragmento de Moesin (que inclui as sequências de ligação à actina) marcado com GFPS65T.
Condutor de serpente-Gal4 específico para hemócitos; srp-Gal4;	Gerado por Katja Bruckner	Gerado por Katja Bruckner	A expressão de Scer\GAL4 fundido a uma cauda poliA é controlada por 2 sequências genômicas a montante da serpente Drosophila. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. O receptor PDGF / VEGF controla a sobrevivência das células sanguíneas em Drosophila. Célula de desenvolvimento. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP w1118;; P{UAS-RedStinger}6	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (Universidade de Indiana)	#8545 ou #8547	As sequências regulatórias de UAS impulsionam a expressão da forma DsRed.T4 de RFP, que é marcada na extremidade do terminal C com um sinal de localização nuclear
UAS-cytoplasmicGFP;; P{UAS-GFP. S65T}	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (Universidade de Indiana)	Vários estoques disponíveis (por exemplo, #1522)	Expressão da versão S65T de GFP por sequências regulatórias de UAS; a variante S65T exibe brilho aumentado.
UAS-fotoconversívelKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (Universidade de Indiana)	#26161	A proteína Kaede emite fluorescência verde brilhante após a síntese, mas muda eficientemente para uma fluorescência vermelha estável brilhante na irradiação com UV.
espaguete com a tag GFP w1118;; P{sqh-GFP.RLC}	Centro de Estoque de Drosophila de Bloomington (Universidade de Indiana)	#57145	A região de codificação sqh, que é marcada na extremidade C-terminal com uma tag T:Avic\GFPS65T, é expressa sob o controle do promotor natural sqh.
Ingredientes para meios alimentares de moscas			Os meios alimentares para moscas são feitos de acordo com procedimentos padrão (ver Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: A Teoria e a Prática da Genética da Drosophila. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
milho	Wild Oats, Bristol, Reino Unido (ou fornecedor equivalente)	Contatar fornecedor direto	orgânico
Farinha de soja	Wild Oats, Bristol, Reino Unido (ou fornecedor equivalente)	Contatar fornecedor direto	orgânico
Extrato de malte	Wild Oats, Bristol, Reino Unido (ou fornecedor equivalente)	Contatar fornecedor direto	orgânico
melaço	Wild Oats, Bristol, Reino Unido (ou fornecedor equivalente)	Contatar fornecedor direto	orgânico
Ágar Difco	BD Biosciences, Fisher Scientific	DF0142-15-2	Para preparação de alimentos para moscas
Ácido propiônico	sigma	402907	Para preparação de alimentos para moscas
Nipagen	sigma	Rolamento 79721	Para preparação de alimentos para moscas
Fermento de padeiro seco	Redstar, Dutscher Scientific, Reino Unido LTD	Redstar, Dutscher Scientific, Reino Unido LTD	Para preparação de alimentos para moscas
Preparação e montagem de amostras
Parafilme	sigma	Pág. P7793-1EA	Para preparação de cola de heptano
Pincel de zibelina fina	Daler-Rowney (ou equivalente)	#0 ou 1
fórceps	Fisher Scientific (ou Ferramentas de Belas Ciências)	NC9404145	Dumont #5
Pratos com fundo de vidro para imagens	MatTek	P35G-0-10-C	Sugerimos o uso de placas de Petri de 35 mm, com pelo menos um micropoço de 10 mm, vidro de cobertura de 0,085-0,13 mm, sem revestimento. Placas com micropoços maiores permitirão que um número crescente de pupas seja montado e fotografado em um único experimento.
Heptano	sigma	51730-5ML	Para preparação de cola de heptano
Fita adesiva dupla face (por exemplo, Scotch)	Agar Científico	AGG263	Para preparação de cola de heptano
Tubo de 50ml (para cola de heptano)	Tubos Falcon da Fisher Scientific	Telefone: 14-432-22	Para preparação de cola de heptano
Lâminas de microscópio de vidro	Agar Científico	AGL4244	Para dissecção de pupas de Drosophila
Microscópio estéreo de dissecação com campo claro	Leica (ou equivalente)	M50	Para dissecção de pupas de Drosophila
Microtesoura	John Weiss Internacional	103123	Tesoura de pesquisa em miniatura (reta)
Ablação e imagem a laser
Laser de ablação de Nitogen	Spectra-Physics (ou equivalente de Andor)	Modelo VSL-337ND-S	Para ferimentos, isso deve ser conectado a um sistema de imagem de campo amplo
Microscópio confocal de varredura a laser multilaser (CLSM)	Leica (ou equivalente)	TCS AOBS SP8 ou SP5-II conectado a um microscópio de epifluorescência invertida Leica DMi8 (ou equivalente)	Idealmente, incluindo uma platina motorizada para varredura em vários locais e 'mosaico', além de detectores GaAsP 'híbridos' (que oferecem sensibilidade muito maior e aumento de sinal baixo)
Câmara ambiental	Serviços de imagem de vida (ou equivalente)	"Sistema de Controle de Temperatura do Microscópio"	Acoplado ao microscópio confocal para controle de temperatura durante a imagem
Software de análise de imagem
Módulo de software FRAP	Leica (ou equivalente)	Módulo de software CLSM FRAP	Para realizar a fotoconversão de fluoróforos fotoconversíveis, como Kaede
ImageJ (software de análise de imagem)	Institutos Nacionais de Saúde (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 anos de análise de imagem". Métodos da Natureza 9, 671-675, 2012.
Plugin ImageJ "Rastreamento Manual"	Institutos Nacionais de Saúde (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
Plugin ImageJ "TrackMate"	ImageJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: Uma plataforma aberta e extensível para rastreamento de partícula única.", Métodos 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (software de imagem 3D de alto desempenho)	Perkin Elmer	Volocidade 6.3	Para análise de imagem
IMARIS (software de análise de imagem)	Plano de bits	IMARIS para biólogos celulares	Para análise de imagem