Um ensaio de opsonidade para avaliar a opsonização de bactérias encapsuladas por anticorpos anticápsula

Resumo

Fonte: Chua, J., et al. Ensaio de Opsono-Adesão para Avaliar Anticorpos Funcionais no Desenvolvimento de Vacinas Contra Bacillus anthracis e Outros Patógenos Encapsulados. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra um ensaio de opsono-aderência para examinar a interação entre bactérias opsonizadas e células imunes. Bactérias marcadas com fluorescência, tratadas com soro de teste contendo anticorpos anticápsula, são incubadas com macrófagos. Após a coloração dos macrófagos com fluorescência, as bactérias aderidas na superfície dos macrófagos são observadas ao microscópio para visualização.

Protocolo

1. Cultura e preparações bacterianas

NOTA: A espécie bacteriana usada neste protocolo é uma cepa virulenta encapsulada, B. anthracis Ames. Todas as manipulações com esta espécie requerem autorizações de biossegurança e segurança apropriadas e devem ser realizadas em um gabinete de segurança biológica Classe II ou Classe III localizado em um laboratório BSL-3. Siga os procedimentos operacionais institucionais para o trabalho BSL-3 e para o uso de equipamentos de proteção individual ao manusear bactérias.

1. Prepare o caldo de infusão de coração cerebral (BHI) dissolvendo 37 g de pó de BHI em 1 L de água e autoclavando a 121 °C por 15 min. Armazene o caldo em temperatura ambiente.
2. Prepare a solução de bicarbonato de sódio a 8% em água e esterilize usando uma seringa de filtro de 0,20 μm. Conservar a solução a 4 °C e utilizar no prazo de 1 dia.
3. Misture 8 g de caldo nutritivo, 3 g de extrato de levedura e 15 g de ágar em 1 L de água para preparar placas de ágar NBY. Autoclave a 121 °C por 15 min. Despeje em placas de Petri e deixe solidificar. Armazenar as placas a 4 °C.
   nota: As placas de ágar NBY podem ser feitas com ou sem bicarbonato de sódio. A adição de bicarbonato de sódio às placas de caldo e ágar induz o crescimento de colônias mucoides constituídas por bacilos encapsulados. A concentração final de bicarbonato de sódio em meios líquidos e sólidos é de 0,8%.
4. Prepare o caldo de cultura para B. anthracis misturando caldo BHI autoclavado a 50%, FBS a 40% e solução de bicarbonato de sódio a 10% (v/v).
   nota: Este caldo é formulado para produzir cadeias curtas de bacilos encapsulados.
5. Prepare um prato principal de B. anthracis listrando-o para isolamento em uma placa de ágar NBY de um caldo de esporos um dia antes de cultivar em caldo. Incubar a 37 °C.
6. Inocular 30 mL de caldo de cultura em um frasco ventilado de 250 mL com várias colônias de B. anthracis.
   nota: Uma proporção específica de volume para superfície do caldo, conforme especificado aqui, é necessária para produzir bacilos encapsulados ao máximo.
7. Agite a cultura do caldo a 125 rpm, 37 °C com 20% de CO₂ e umidade por 18–24 h.
   nota: O cultivo de B. anthracis em temperaturas superiores a 37 °C pode inibir a produção de cápsulas.
8. Use coloração negativa com tinta nanquim para garantir encapsulamento suficiente e que os bacilos estejam em cadeias curtas (1–5 bacilos/cadeia) antes da fixação (consulte a seção 2).
9. Para determinar as unidades formadoras de colônias (UFC), diluir em série 100 μL de cultura 1:10 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e diluições de cultura em placas de ágar sangue de ovelha. Incubar por 12–18 h a 37 °C. Contar UFC e determinar o número de bactérias por mL de cultura.
   nota: A contagem também pode ser realizada usando um hemocitômetro ao microscópio, uma vez que as bactérias tenham sido fixadas. No entanto, isso não é recomendado porque os bacilos são difíceis de ver sob baixa ampliação.
10. Adicionar 16% de paraformaldeído (PF) a todo o volume da cultura bacteriana a uma concentração final de 4% de PF para fixar os bacilos. Agite lentamente em uma coqueteleira em temperatura ambiente por 7 dias.
    nota: Sete dias de incubação em 4% de PF são baseados no procedimento operacional padrão institucional do Instituto de Pesquisa Médica de Doenças Infecciosas do Exército dos Estados Unidos (USAMRIID) para fixação de bacilos vegetativos.
11. Para remover o fixador e testar a esterilidade, lave três vezes 4 mL (10% do volume) de suspensão bacteriana fixa em um tubo cônico de 50 mL por centrifugação a ≥3000 x g por 45 min e usando 30 mL / lavagem com PBS. Armazenar a amostra restante em 4% PF a 4 °C.
    nota: Após a peletização, o pellet bacteriano fica fofo devido à presença de uma cápsula. Tome cuidado para não perturbar o pellet durante a lavagem. É necessário remover todo o fixador para que não interfira no teste de viabilidade. Se necessário, aumente o número de lavagens.
12. Para testes de viabilidade, inocular 40 ml de um meio de crescimento bacteriano (por exemplo, caldo BHI) com 4 ml de suspensão lavada (≤ 10% do volume do caldo) e incubar a 37 °C durante 7 dias. Verifique a densidade óptica em 600 nm antes e depois de 7 dias para medir a turbidez.
13. Após 7 dias de incubação em cultura de caldo, coloque ≥100 μL de caldo em uma placa de ágar e incube por mais 7 dias. Se não for observado aumento da turbidez e nenhum crescimento nas placas, a cultura original é considerada estéril e pode ser transferida para um laboratório BSL-2.
    NOTA: O Federal Select Agent Program determina que B. anthracis inativado só pode ser transferido dos laboratórios BSL-3 após demonstrar a esterilidade completa da amostra. O teste de viabilidade para B. anthracis inativado consiste em cultura de 10% da amostra em caldo por 7 dias, seguida de cultura em meio sólido por mais 7 dias. Siga as diretrizes institucionais para receber a aprovação da transferência assim que a esterilidade for estabelecida.         

2. Coloração negativa e microscopia óptica para observar encapsulamento e cadeias de bacilos

1. Misture 5 μL de suspensão bacteriana com 2 μL de tinta da China em uma lâmina de microscópio. Coloque uma lamínula de 1 ou 1,5 μm de espessura no topo da suspensão sem criar bolhas.
   nota: O esmalte pode ser usado para selar a lamínula na lâmina.
2. Observe a suspensão bacteriana usando uma lente objetiva de óleo de 40x a 100x em um microscópio óptico. Certifique-se de que os bacilos sejam encapsulados observando uma zona de depuração (cápsula exclui tinta nanquim) ao redor de cada bactéria e que as cadeias de bacilos sejam curtas.

3. Marcação FITC de bactérias

1. Dissolver o isotiocianato de fluoresceína (FITC) em dimetilsulfóxido na concentração de 2 mg/ml.
2. Meça o volume do estoque bacteriano inativado.
3. Lave o caldo 3x em PBS para remover o fixador.
4. Adicionar a solução FITC a uma concentração final de 75 μg/ml. Agite lentamente a mistura por 18–24 h a 4 °C.
5. Lave três vezes as bactérias peletizando a ≥3000 x g, 45 min e usando 30 mL de PBS/lavagem para remover o excesso de FITC. Certifique-se de que o pellet fofo não seja perturbado durante a lavagem. Ressuspenda os bacilos em PBS no mesmo volume inicial.
6. Alíquota e armazenar os bacilos em microtubos a -20 °C até à utilização. Não congele/descongele os bacilos várias vezes, pois os bacilos podem perder a cápsula.

4. Opsonização bacteriana

1. Inativar pelo calor um pequeno volume de soros de ensaio (de primatas não humanos, NHP) a 56 °C durante 30 minutos num bloco de calor.
2. Descongele e lave as bactérias marcadas com FITC com PBS 2x peletizando a 15000 x g por 3–5 min. Ressuspenda em PBS no mesmo volume inicial.
3. Em uma placa de fundo redonda de 96 poços (placa # 2), diluir serialmente os soros de teste em meio celular. Em outra placa inferior redonda de 96 poços (placa #3), adicione 10 μL de soros de teste diluídos em cada poço.
   nota: Em todas as placas, PBS e soros normais de macacos foram incluídos no lugar de soros de teste diluídos como controles negativos. Também escolhemos um soro teste como controle positivo para gerar uma curva padrão para normalizar todos os ensaios feitos em dias diferentes. O soro do teste de controle positivo foi escolhido arbitrariamente porque era abundante.
4. Na placa # 3, adicione 10 μL de complemento de coelho bebê recém-reconstituído.
   nota: Depois de reconstituído, descarte o complemento restante do coelho bebê; Não congele novamente e descongele.
5. Na placa # 3, adicione o volume apropriado de bacilos marcados com FITC para uma multiplicidade de infecção de 1:20. Por exemplo, adicione o volume que contém 5 x 10⁴ x 20 bacilos para 5 x 10⁴ células. Complete cada poço na placa #3 com o volume apropriado de meio celular para totalizar 105 μL.
   nota: A placa # 1, que contém células, recebe 100 μL de bactérias opsonizadas com os 5 μL restantes como volume vazio. O Tribunal testou cada diluição dos soros de ensaio em duplicado.
6. Incubar a placa #3 a 37 °C por 30 min na presença de 5% de CO₂ com umidade para opsonizar bacilos.

5.Ensaio de Adesão e Marcação Fluorescente de Células de Mamíferos

1. Manter todos os reagentes a 37 °C antes de utilizar.
2. Coloque a placa #1, que contém células aderentes, em um bloco de calor de 37 °C.
3. Use um pipetador multicanal para remover o meio gasto dos poços e substitua-o rapidamente por 100 μL de bactérias opsonizadas da placa #3. Certifique-se de que nenhuma bolha tenha sido gerada nos poços durante a pipetagem. Incubar a placa #1 a 37 °C com 5% de CO₂ e umidade por 30 min para aderência.
4. Lave cada poço 5x com 150 μL de PBS em cima de um bloco de calor a 37 °C para remover bacilos soltos.
   nota: Deve-se tomar cuidado para garantir que as células não sejam acidentalmente dispersas durante a lavagem.
5. Dilua 16% de PF com PBS 1:4 para fazer 4% de PF. Fixe as células com 4% de PF por 1 h adicionando 150 μL a cada poço. Lave as células 2x com PBS.
6. Misture 2 μL de HCS (triagem de alto conteúdo) de corante de células laranja em 10 mL de PBS. Adicione 150 μL desta solução de coloração às células fixas e incube por 30 min à temperatura ambiente.
7. Lave os poços 2x com PBS.
8. Conservar a 4 °C até à microscopia.

6. Microscopia

NOTA: Em geral, um microscópio de fluorescência automatizado de alto rendimento facilitará a aquisição de imagens para o OAA. Se um sistema automatizado não estiver disponível, as imagens fluorescentes dos bacilos aderentes podem ser obtidas manualmente. Neste estudo, bacilos aderentes e monocamadas celulares foram visualizados usando o sistema de microscopia de varredura a laser Zeiss 700 com equipamento especializado; nosso sistema era composto pelo microscópio invertido Zeiss Axio Observer Z1 equipado com platina automatizada, módulo Definite Focus, objetiva 40 x NA 0,6, câmera Axio Cam HRc e software Zen 2012 (Blue Edition). As imagens adquiridas são imagens de campo amplo, não imagens confocais. O protocolo a seguir destina-se a uma configuração básica de microscópio aplicável a uma variedade de sistemas de microscopia automatizados.

1. Incube a placa #1 em temperatura ambiente por 30 min. Ligue o microscópio e equipamentos relacionados.
   nota: A aclimatação à temperatura ambiente evita a formação de condensação na placa de vidro durante a geração de imagens. Além disso, evita a desfocagem devido a mudanças de temperatura.
2. Coloque a placa no palco e concentre-se nas células usando um campo claro ou contraste de fase.
3. Selecione o formato de 96 poços como configuração da placa. Selecione as configurações do canal.
   nota: O comprimento de onda de pico de excitação e emissão do FITC é de 495/519 nm; as colorações de células laranja HCS são 556 e 572 nm. Outros fluoróforos podem ser usados dependendo dos filtros disponíveis no microscópio.
4. Selecione a configuração para o modo Lado a lado. Indique o número de imagens a serem adquiridas.
   nota: A função lado a lado permite a captura de vários locais em um poço de amostra e pode ser configurada para adquirir uma imagem em um formato lado a lado ou aleatório. Fotografamos 10 áreas aleatórias por poço.
5. Altere o modo de aquisição para "preto e branco" ou "monocromático" e binning ≥ 2x2.
   nota: Definir o compartimento de 1x1 para 2x2 ou 4x4 aumentaria a velocidade da microscopia, mas também resultaria em uma resolução mais baixa da imagem. Para OAA, é suficiente usar essas configurações, pois o ensaio enumera os macrófagos e as bactérias aderentes.
6. Ligue o foco automático ou o módulo de foco. Indique com que frequência a função de focagem automática deve ser executada. Ative a função de pilha Z, se disponível. Indique o número de pilhas Z que irão capturar a espessura da monocamada celular e dos bacilos aderentes.
   nota: O número de pilhas Z escolhidas aumentará o tempo de microscopia, mas garantirá que uma imagem com o foco correto seja tirada em cada pilha Z.
7. Designe uma pasta de arquivos para salvar as imagens. Execute o programa de imagem automatizado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de seringa de 0,20 μm (25 mm, celulose regenerada)	Corning, Corning, NY	431222
Seringa de 10 mL (ponta Luer-Lock)	BD, Lagos Franklin, NJ	302995
Placas pretas de 15μ 96 poços (placa #1 para imagem)	In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA	P96-1-N
16% de paraformaldeído	Ciência da Microscopia Eletrônica, Hatfield, PA	15710
Balão tratado para cultura de tecidos de 75 cm quadrados	Corning, Corning, NY	430641
Ágar (pó)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Resposta A1296
Complemento Coelho Bebê	Laboratórios Cedarlane, Burlington, Carolina do Norte	CL3441
Extrato de levedura Bacto	BD, Faíscas, MD	Rolamento 288620
Infusão de coração cerebral BBL (BHI)	BD, Faíscas, MD	211059
Placas de ágar sangue (TSA com sangue de ovelha)	Remel, Lenexa, KS	R01198
Raspador de células	Sarstedt, Newton, Carolina do Norte	83.183
Placas de cultura de células Costar de 96 poços (placas #2 & 3 para diluições)	Corning, Corning, NY	3596
Vidro de cobertura	Ciência da Microscopia Eletrônica, Hatfield, PA	72200-10
Caldo de Nutrientes Difco	BD, Faíscas, MD	Nº 234000
Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	11965-092	Contém 4500 mg/L de glicose, 4 mM de L-glutamina, Vermelho de Fenol
Sistema de imagem celular automática EVOS FL (microscópio de fluorescência)	Tecnologias da Vida, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AMAFD1000
Soro fetal bovino	Hyclone, Ciências da Vida da GE Healthcare, South Logan, UT	SH30071.03	Não irradiado por gama, não inativado por calor
Isotiocianato de fluoresceína	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	F143
HCS Cell Mask Orange Cell Stain	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	H32713
hemocitômetro (Neubauer melhorado)	Hausser Scientific, Horsham, PA	3900
Solução da tinta nanquim	BD, Faíscas, MD	261194
L-glutamina (200 mM)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA	25030081	Suplemento médio com L-glutamina 2mM adicional
Nikon Eclipse TE2000-U (microscópio composto invertido)	Instrumentos Nikon, Melville, NY	TE2000
PBS sem cálcio ou magnésio	Lonza, Walkersville, MD	17-516F
Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100x	Hyclone, Ciências da Vida da GE Healthcare, South Logan, UT	SV30010
Placas de Petri (100 x 15 mm)	Falcão, Corning, Durham, Carolina do Norte	351029	Para placas de ágar
Linha celular de macrófagos RAW 264.7 (Tib47)	ATCC, Manassas, VA	ATCC TIB-71
Slides	VWR, Radnor, PA	16004-422
bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S5761
Solução de Azul de Tripano (0,4%)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T8154
Microscopia de varredura a laser Zeiss 700 (microscópio confocal)	Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY	4.109E+15