Avaliação da ativação controlada de células T com um peptídeo fotoativável MHC

Resumo

Fonte: Sanchez, E., et al. Controle espacial e temporal da ativação de células T usando um agonista fotoativável. J. Vis. Exp. (134), (2018)

Este vídeo demonstra um método de decaging de um complexo de histocompatibilidade peptídeo maior fotoativável usando irradiação UV. O processo de decaging expõe a sequência de peptídeos nativos, permitindo a ativação precisa das células T.

Protocolo

1. Preparação de superfícies de vidro estimulatórias

1. Cubra a lamínula com câmara de oito poços com poli-L-lisina biotinilada (Bio-PLL) diluída a 1:500 em água destilada e deionizada (ddH₂O). Incube por 30 minutos em temperatura ambiente (RT).
2. Lavar com H₂O.
3. Seque por 2 h em RT.
4. Bloqueie as superfícies revestidas com Bio-PLL com tampão de bloqueio (solução salina tamponada com HEPES [HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM], com 2% de BSA) por 30 min em RT.
   1. Dissolva 5 mg de bromidrato de poli-L-lisina em 1 mL de NaPO4 10 mM, pH 8,5.
   2. Adicione 125 μmol (0,55 mg) de NHS-biotina (de um estoque de 100 mg / mL em DMSO) e verifique o pH da reação. Se o pH estiver abaixo de 8,5, adicione 2 μL de NaOH 4 N para aumentá-lo para entre pH 8,5 e 9,5.
   3. Vórtice por 30 min.
   4. Extinguir a reação com 50 μL de glicina 100 mM dissolvida em Tris pH 8,0 20 mM.
   5. Gire na potência máxima por 10 min e transfira o sobrenadante para um novo tubo.
      NOTA: A qualidade do Bio-PLL é normalmente comparada às preparações anteriores, revestindo diluições duplas em série do material em uma placa ELISA de 96 poços e quantificando o conteúdo de biotina após incubação com estreptavidina acoplada à fosfatase alcalina.
5. Remova o buffer de bloqueio. Não deixe os poços secarem. Adicione estreptavidina (100 μg/ml em tampão de bloqueio). Incubar durante 1 h a 4 °C.
6. Lave em HBS. Encha e inverta os poços de deslizamento da câmara 4 a 5 vezes, removendo o HBS dos poços. Não deixe os poços secarem.
7. Adicione os ligantes pMHC biotinilados e as moléculas de adesão à superfície.
   nota: O MCC e o OVA podem ser fotoenjaulados adicionando grupos protetores à base de orto-nitrobenzil (por exemplo, nitrofeniletil (NPE) ou nitroveratritiloxicarbonil (NVOC)) ao grupo ε-amino das principais lisinas (K12 no MCC, K7 no OVA). MCC e OVA fotoenjaulados podem ser obtidos de fornecedores comerciais. Após a reconstituição em tampão aquoso, eles são redobrados em I-E^k e H2-K^b expressos por bactérias usando abordagens estabelecidas.
8. Validação de MCC fotoativável ou peptídeo OVA
   1. Decage peptídeos protegidos por NVOC por irradiação UV com uma lâmpada UV portátil (consulte a Tabela de Materiais) por 20 min em RT.
   2. Pulso 1,0 x 10⁵ APCs com 1 μM de peptídeo não estimulatório (controle negativo, por exemplo, Hb), peptídeo fotoativável não irradiado, peptídeo fotoativável irradiado e peptídeo agonista (controle positivo, por exemplo, MCC) por 1 h a durante a noite a 37 ° C.
   3. Para estimular as células T que expressam o 5C. C7 / 2B4 / E TCR, use células B CH12 ou CH27. Para estimular as células T OT1, use células de timoma RMA-s ou EL4.
   4. Misture as APCs pulsadas com um número igual de células T em placas de fundo redondas de 96 poços com um volume final de 200 μL. Incubar a 37 °C por 12 - 24 h.
   5. Recuperar os sobrenadantes de cada poço e analisar IL-2 por ELISA com detecção colorimétrica estreptavidina-rábano peroxidase.
      NOTA: A confirmação do status de enjaulamento de todos os peptídeos por espectrometria de massa por eletrospray antes do redobramento em complexos MHC é fortemente recomendada.
9. Realize o dobramento e a purificação do MHC de modo a minimizar a exposição à luz. Por exemplo, enrole as reações de dobramento em papel alumínio e faça a cromatografia de filtração em gel com a lâmpada UV desligada.
   nota: Verificou-se que MCC-I-E^k e OVA-H2-K^b fotoativáveis induzem a ativação de células T independentes de UV em alta densidade, possivelmente devido ao enjaulamento funcional incompleto. Assim, o pMHC fotoativável é diluído em um excesso de 10 a 30x de pMHC não estimulatório (por exemplo,^{I-E k} contendo o peptídeo de hemoglobina (Hb)) durante a etapa de imobilização. Isso aumenta a relação sinal-ruído do experimento de imagem subsequente.
10. Para fotoativar as células T CD4⁺, use coletivamente uma mistura de Hb-I-Ek biotinilada (3 μg/mL), MCC-I-E^k fotoativável biotinilada (0,1 μg/mL) e anticorpo biotinilado contra o MHC H2-K^k classe I (0,5 μg/mL). O anticorpo anti-H2-K^k estimula o 5C. As células C7/2B4/E T, que expressam H2-K^k, se espalham na superfície do vidro sem sofrer ativação.
11. Para células T CD8⁺, use uma mistura de H2-Db biotinilada contendo o peptídeo KAVYDFATL (1 μg/mL), OVA-H2-Kb fotoativável biotinilado (0,1 μg/mL) e o domínio extracelular da molécula de adesão ICAM-1 (2 μg/mL produzida por cultura de células de insetos). O ICAM-1 estimula a formação de contato próximo envolvendo a integrina LFA1 na superfície da célula T.
12. Aplicar todas as misturas proteicas em tampão de bloqueio, seguido de incubação durante 1 h a RT ou pelo menos 2 h a 4 °C.
    nota: A densidade molecular em superfícies deste tipo é ~ 8000 por μm2 foi previamente determinada. Dado que o pMHC fotoativável representa ~ 1/30 da proteína biotinilada na superfície, sua densidade será de ~ 267 moléculas por μm2, antes do decaging.
13. Lave como na etapa 1.6 e deixe no HBS até a hora de usar.
14. Adicione 200.000 células T CD4⁺ ou CD8⁺ expressando o TCR apropriado em cada poço e deixe as células aderirem a 37 °C por 15 min. Uma vez que as células se ligam e se espalham na superfície, elas estão prontas para fotoativação e imagem.
    nota: A transdução retroviral de células T efetoras com sondas de imagem fluorescentes é descrita em detalhes em outro lugar. A sinalização de cálcio também pode ser estudada usando células T não transduzidas carregadas com o corante sensível ao cálcio Fluo-46. O corante raciométrico Fura-2 não é recomendado porque requer excitação na faixa UV, o que também induz o decaging do pMHC fotoativável.

2. Aquisição de Imagens

1. Use um microscópio TIRF invertido equipado com uma lente objetiva de 150X compatível com UV para aquisição de imagens. Irradie regiões definidas pelo usuário por UV usando um sistema de diafragma digital conectado a uma lâmpada de mercúrio (HBO) de 100 W. Direcione a luz UV desta lâmpada para a amostra usando um espelho de passagem longa de 400 nm.
2. Use um software de análise de imagem para fotoativação localizada e aquisição de lapso de tempo. Na maioria dos experimentos, monitore as sondas nos canais verde e vermelho usando lasers de excitação de 488 nm e 561 nm, respectivamente. A luz do laser é direcionada para a amostra usando um espelho dicróico de passagem de banda dupla que também transmite na faixa UV (para permitir o decaging). Consulte a Tabela de Materiais e a Figura 1 para obter informações adicionais sobre a configuração do microscópio.
3. Depois de montar a lâmina da câmara que contém as células T, ajuste as configurações para obter iluminação TIRF ou epifluorescência, conforme necessário. No modo ao vivo, selecione um campo de células que estão expressando a(s) sonda(s) fluorescente(s) de interesse. Estabeleça regiões em escala de mícron para fotoativação sob células individuais usando o controle de software.
4. Comece a aquisição de lapso de tempo. Normalmente, 80 pontos de tempo são adquiridos, com um intervalo de 5 s entre cada ponto de tempo. Isso deixa tempo mais do que suficiente para exposições sequenciais de 488 nm e 563 nm, no caso de experimentos de duas cores.
5. Após 10 pontos de tempo, fotoative as regiões selecionadas abrindo o obturador de diafragma digital por 1 - 1,5 seg.
6. Após a conclusão do lapso de tempo, selecione um novo campo de células e repita o processo.

Resultados

Figura 1: Configuração do microscópio para fotoativação e imagem TIRF.

Os lasers de 488 nm e 561 nm são usados para imagens TIRF e epifluorescência de sondas verdes e vermelhas, respectivamente. A luz UV para fotoativação é retirada de uma lâmpada de mercúrio (Hg) conectada a um sistema de diafragma digital capaz de iluminar pequenas regiões definidas pelo usuário. A luz d...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nunc Lab-Tek Tampa de Vidro com Câmara	Thermofischer Scientific	155361
Bromidrato de poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	Pág. 2636	Precisará fazer poli-L-lisina biotinilada
EZ-Link NHS-Biotina	Thermofischer Scientific	20217	Precisará fazer poli-L-lisina biotinilada
Estreptavidina	Thermofischer Scientific	434301
BirA-500: Kit de reação padrão de biotina-proteína ligase BirA	avidez	BirA500	Será usado para biotinilar proteínas
Hb I-EK biotinilada			Para o dobramento de proteínas, consulte a referência 6. Para biotinilação, use o kit BirA
NPE-MCC I-EK biotinilado	Anaspec		NPE-MCC personalizado (HANERADLIAYL-K (Nvoc) -QATKOH) pode ser adquirido na Anaspec
Anticorpo αH2-Kk biotinilado	BD Biociências	553591
NPE-OVA biotinilado H2-Kb	Anaspec		NPE-OVA (H-SIINFE- personalizado K(Nvoc)-L-OH) pode ser comprado na Anaspec
KAVY H2-Db biotinilado	Anaspec		Proteína sintetizada personalizada (KAVYDFATL) pode ser adquirida na Anaspec
ICAM1 biotinilado			Para dobramento de proteínas, consulte a referência no protocolo. Para biotinilação, use o kit BirA
Lâmpada UV à mão	UVP	UVGL-25	A lâmpada é mantida < 1 cm da amostra. 30 s de 365 luz são suficientes para decaging detectável, 20 min para decaging quantitativo.
Sistema Olympus IX-81 OMAC TIRF.	Olimpo		Informações adicionais sobre o sistema de imagem podem ser encontradas na Figura 6
Diafragma digital em mosaico	Andor
Software de slidebook	Inovações em imagens inteligentes