Avaliação da topologia imunológica de sinapses por meio de imagens de células vivas

Resumo

Fonte: Martinelli, R. et al., Um modelo de célula planar endotelial para imagem da dinâmica imunológica da sinapse.J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra imagens de células vivas da topologia de sinapses imunológicas, investigando as interações entre linfócitos T e células epiteliais que carregam antígenos fluorescentes. A microscopia de fluorescência revela deslocamento do citoplasma vermelho e anéis de membrana amarela nas células endoteliais, indicando a formação de sinapses imunológicas.

Protocolo

1. Preparando células T efetoras/de memória CD4⁺ Th1 humanas

1. Aplique um torniquete no braço do doador, limpe a veia com álcool e insira uma agulha. Aspire lentamente 15 ml de sangue para um vacutainer usando EDTA como anticoagulante. Quando o sangue for coletado, desamarre o torniquete antes de remover a agulha. Aplique pressão imediatamente na ferida com gaze estéril quando a agulha for removida.
2. Transfira o sangue para um tubo de 50 ml. Adicionar RPMI-1640 à RT numa diluição de 1:1 (volume final de 30 ml). Cubra cuidadosamente o sangue diluído em dois tubos de 50 ml contendo 15 ml de meio de isolamento de linfócitos pré-filtrado, como Ficoll-Paque em RT.
3. Centrifugue o gradiente em RT por 30 min a 1.200 x g em um rotor de caçamba oscilante. Durante a centrifugação, prepare o meio de células T (500 ml de RPMI-1640, 50 ml de FCS, 5 ml de penicilina/estreptomicina).
4. Após a remoção do tubo de 50 ml da centrífuga, observe quatro camadas: um pellet de glóbulos vermelhos no fundo, o paque, uma camada de células que contém glóbulos brancos (incluindo linfócitos) e o plasma. Remova cuidadosamente a camada de glóbulos brancos com uma pipeta Pasteur e transfira-a para um tubo Falcon de 50 ml.
5. Lave a camada de glóbulos brancos adicionando RT RPMI-1460 (até 20 ml) e centrifugando em RT por 5 min a 1.200 x g. Ressuspenda os glóbulos brancos em 1 ml de meio de células T. Adicionar 5 μl da suspensão celular de 1 ml a 250 μl de meio de células T num tubo de centrifugação de 1,5 ml e misturar suavemente para cima e para baixo com uma pipeta.
6. Adicionar 25 μl de suspensão celular diluída a 25 μl de azul de tripano a 0,4%. Adicione 10 μl de mistura a cada lado de um hemocitômetro padrão.
7. Coloque o hemocitômetro em um microscópio de luz de baixa potência. Usando uma contagem objetiva de 10X, o número de células vivas que excluíram o corante azul de tripano e estão presentes no quadrado médio de ambos os lados do hemocitômetro.
8. Para calcular a concentração celular, multiplicar a média dos 2 quadrados por 100 (factor de diluição) e multiplicar por 10⁴ para obter o número de células/ml.
9. Ajustar a concentração final para 0,5 x 10⁶ células/ml em meio de células T. Adicione uma concentração final de 1 μg/ml de superantígenos bacterianos estafilocócicos enterotoxina B (SEB) e toxina 1 da síndrome do choque tóxico (TSST) às células. Cultura por 72 horas (37 °C e 5% de CO₂) para expandir a população de células T CD4⁺.
10. Células T pellet (1.200 x g, 5 min) e ressuspender a 0,5 x 10⁶ células/ml em meio de células T com a adição de IL-15 humana (20 ng/ml). Transferir os linfócitos para um balão T150. Continue a expandir/dividir as células em IL-15 médio completo a cada 24-48 horas, conforme necessário (com base na cor do meio; ou seja, sempre que a mídia muda de rosa para ligeiramente amarelo) depois disso. Manter a população de linfócitos resultante por até 15 dias.
    nota: Por design, este protocolo ativará e expandirá especificamente um subconjunto de células T CD4 ⁺ que são reativas a SEB e TSST e, em seguida, as conduzirá a um fenótipo efetor / memória semelhante a Th1. Outros glóbulos brancos não sobrevivem e crescem nessas condições, de modo que, na etapa 1.10, as células terão pelo menos 95% de células T CD4⁺, CD45RO⁺, como pode ser prontamente avaliado por citometria de fluxo. Se desejado, uma purificação adicional pode ser facilmente alcançada por meio de kits de seleção positiva ou negativa baseados em anticorpos/esferas magnéticas disponíveis comercialmente.

2. Iniciando a cultura primária de células endoteliais humanas

1. Cubra um balão T25 com fibronectina (FN) 20 μg/ml em PBS em condições estéreis. Deixe em RT por 30-60 min. Remover FN e adicionar 5 ml de meio completo (meio basal endotelial (EBM-2) suplementado com meio de crescimento endotelial (EGM-2) de aspas simples). Pré-incubar numa incubadora de cultura de células a 37 °C durante, pelo menos, 30 min.
2. Descongele um frasco para injetáveis de pulmão humano congelado ou células endoteliais microvasculares dérmicas (HLMVECs ou HDMVECs) em banho-maria a 37 ° C com agitação suave ocasional por ~ 2-3 min. Transfira imediatamente as células para o frasco T25 contendo meios pré-aquecidos. Agite suavemente e coloque em uma incubadora a 37 °C.
3. Troque a mídia após ~4-6 horas. Continue a trocar a mídia aproximadamente a cada 48 horas (ou quando a mídia ficar ligeiramente amarela) até que a placa atinja ~90-95% de confluência.

3. Divisão Geral e Expansão de Células Endoteliais

1. Cultive células até ~ 90-95 de confluência. Isso pode levar de 2 a 5 dias. Para dividir, remova a mídia e enxágue com PBS. Remova o PBS e substitua por um volume mínimo de 1x tripsina fresca (0,5 ml para T25 ou 1,5 ml para T75). Agite suavemente para cobrir todas as superfícies com tripsina. Incubar a 37 °C durante ~5 min. Monitore o desprendimento das células da placa usando um microscópio de luz de baixa potência.
2. Quando a maioria das células parecer arredondada ou destacada, adicione 5 volumes (ou seja, em comparação com o volume de tripsina adicionado) de meio EGM-2 completo pré-aquecido e pipete suavemente sobre a superfície do frasco para separar todas as células.
3. Conte as células endoteliais com um hemocitômetro, conforme descrito em 1.6-1.7. Pellet as células por centrifugação (5 min, 1.200 x g). Remova o sobrenadante. Ajuste a concentração para 0,5 milhão de células por ml pela adição de meio MV EGM-2 completo pré-aquecido.
4. Transferir alíquotas de células para os pratos ou frascos revestidos de FN adequados para manutenção. Gire suavemente e coloque na incubadora. Troque a mídia dentro de 6 a 12 horas após o revestimento. A mídia deve ser trocada aproximadamente a cada 48 horas a partir de então.

4. Transfecção de células endoteliais

NOTA: As células endoteliais primárias são refratárias à transfecção pelos métodos químicos e de eletroporação mais comuns. O método baseado em transfecção nuclear descrito abaixo permite uma eficiência de transfecção relativamente alta (~ 50-70%). Um método alternativo eficaz é o uso de infecção por vetores virais apropriados (ver comentários na Tabela de Materiais).

1. Preparar frascos T25 ou T75 (conforme necessário) de HLMVECs ou HDMVECs até uma densidade final de 90-95% de confluência. Revestir com fibronectina (FN) 20ug/ml em PBS em condições estéreis, quer em placas de cultura microscópicas, tais como placas Delta-T (para o passo 5), quer lamínulas de vidro circulares de 12 mm colocadas no interior de um alvéolo de uma placa de cultura de células de 24 poços (para o passo 6), conforme descrito acima (2.1).
2. Adicione 1 ml de meio de cultura EGM-2 completo às placas de cultura do microscópio ou 0,5 ml a cada 24 poços e placas de equilíbrio em uma incubadora umidificada a 37 ° C / 5% de CO₂.
3. Colha e conte as células endoteliais como nas etapas 3.1-3.3. Centrifugue o volume necessário de células (0,5 milhão de células por amostra) a 1.200 x g por 5 min em RT. Ressuspenda cuidadosamente o pellet de célula em 100 μl de solução de transfecção nuclear RT por amostra.
4. Combine 100 μl de suspensão celular com 1-5 μg de DNA. Transferir a suspensão de células/ADN para uma cubeta certificada; A amostra deve cobrir o fundo da cubeta sem bolhas de ar.
   NOTA: Construtos direcionados a YFP ou DsRed para a membrana celular (através dos 20 aminoácidos N-terminais da neuromodulina que contém um sinal para palmitoilação pós-tradução) foram usados isoladamente (membrana-YFP sozinho ou membrana-DsRed sozinho) ou co-transfectado com um marcador volumétrico citoplasmático (por exemplo, membrana-YFP e DsRed solúvel). Muitas permutações de marcadores proteicos fluorescentes podem ser usadas.
5. Feche a cubeta com a tampa. Insira a cubeta com suspensão de célula/DNA no suporte da cubeta do eletroporador e aplique o programa de eletroporação S-005. Retire a cubeta do suporte assim que o programa terminar.
6. Adicione ~ 500 μl do meio de cultura pré-equilibrado à cubeta e remova suavemente a suspensão celular da cubeta usando as pipetas de transferência de plástico fornecidas no kit de transfecção nuclear.
7. Para experimentos usando um microscópio, as placas de cultura dividem a suspensão celular de uma reação igualmente entre dois pratos contendo meios pré-aquecidos (Etapas 4.2-4.3). Para experimentos usando 24 poços/placas, divida uma reação igualmente entre 3 poços.
8. Incube as células em uma incubadora umidificada a 37 ° C / 5% de CO₂ e troque o meio 4-6 horas e novamente 12-16 horas após a transfecção.

5. Imagem e análise de células vivas

1. Preparando o endotélio
   1. Dia 0: Cotransfectar HLMVECs primários com membrana-YFP e DsRed solúvel por meio de uma tecnologia de nucleofecção conforme descrito na etapa 4 e placa em placas de cultura de imagem de células vivas.
   2. Dia 1: Substitua o meio por meio fresco contendo IFN-γ (100 ng/ml) para induzir a expressão de MHC-II. No dia 2. Estimular as células transfectadas pela adição de 20 ng/ml de TNF-α ao meio existente.
   3. No dia 3, incube o endotélio com 1 μg/ml de superantígenos bacterianos estafilocócicos enterotoxina B (SEB) e toxina da síndrome do choque tóxico 1 (TSST) a 37 ° C por 30-60 min imediatamente antes dos experimentos. Omita esta etapa para as condições de controle '-Ag'.
2. Preparando linfócitos
   1. Paralelamente à etapa 5.1.3, prepare o tampão A (HBSS sem vermelho de fenol) suplementado com HEPES 20 mM, pH 7,4 e albumina sérica humana a 0,5% v / v pré-aquecida a 37 ° C. Pegue uma amostra de linfócitos cultivados e determine a densidade contando com um hemocitômetro (Etapa 1.12-1.17).
   2. Centrifugue 2 milhões de células por amostra a 1.200 x g por 5 min em RT em um tubo cônico de 15 ml. Aspirar o meio e ressuspender suavemente o sedimento celular em 2 ml de tampão A, de modo a que não permaneçam aglomerados de células.
   3. Remover uma nova alíquota de corante de cálcio Fura-2 e ressuspender em DMSO para obter uma concentração de reserva de 1 mM.
   4. Adicione 2 μl de solução estoque de Fura-2 à suspensão de células T (concentração final de 2 μM), tampe o tubo e misture imediatamente invertendo o tubo para garantir uma dispersão uniforme do corante. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   5. Centrifugar como indicado no passo 5.2.2. Aspire o tampão-A e ressuspenda suavemente, mas completamente, os linfócitos em 20-40 μl de tampão-A fresco.
3. Configuração e aquisição de imagens de células vivas
   NOTA: Uma ampla variedade de sistemas pode ser empregada para imagens de fluorescência de células vivas em microscópios verticais e de luz invertida. Os requisitos básicos incluem uma fonte de luz de fluorescência e filtros, uma câmera CCD, comutação de filtro motorizada e obturadores, um estágio aquecido (ou câmara aquecida montável em microscópio) e software para aquisição automatizada de imagens. Para este protocolo, são necessárias lentes de imersão em óleo de alta abertura numérica e alta ampliação (ou seja, 40X, 63X) para atingir a resolução espacial necessária. Deve-se tomar cuidado especial na escolha da fonte de fluorescência e lentes apropriadas para imagens de cálcio baseadas em Fura-2, pois nem todas são compatíveis com os comprimentos de onda de excitação de 340/380 nm necessários. Uma abordagem alternativa (compatível com conjuntos de filtros de fluorescência verde e vermelho padrão) pode ser usada com corantes sensíveis ao cálcio não raciométricos (por exemplo, Fluo-4, Rhod-3), embora estes não possam quantificar com precisão o fluxo de cálcio e forneçam apenas uma leitura relativa/quantitativa.
   1. Ligue o sistema de microscópio (PC para operação, microscópio, câmera CCD, roda de filtro e lâmpada de xenônio).
   2. Abra o software designado.
   3. Configure o microscópio/software para imagens automatizadas de lapso de tempo multicanal. Inclua aquisição sequencial de contraste de interferência diferencial (DIC), fluorescência verde padrão, fluorescência vermelha padrão e imagens Fura-2 de excitação padrão de 340 e 380 nm. Defina o intervalo para aquisição de 10 a 30 segundos e uma duração total de ~ 20 a 60 minutos.
      1. Defina os tempos de exposição para imagens do Fura-2.
         1. Adicione óleo de objetiva fresco e monte uma placa de microscópio contendo apenas 0.5 ml de Buffer-A no adaptador de estágio de aquecimento e ligue imediatamente para equilibrar a 37 ° C (levará ~ 2-3 min).
         2. Adicione linfócitos carregados com Fura2 em repouso à câmara do prato do microscópio montada usando uma pipeta de 20 μl.
         3. Ative a imagem de campo claro. Selecione o caminho da luz para as oculares. Use o botão de foco grosso para colocar a objetiva em contato com a parte inferior da placa do microscópio. Use a ocular e o botão de foco fino para focar as células T instaladas na parte inferior do prato.
         4. Use os controles de estágio x-y para selecionar um campo que contenha pelo menos 10 células. Evite campos superlotados e aglomerados de células, pois eles criarão artefatos de imagem.
         5. Mude de um campo claro para uma fonte de luz fluorescente. Mude da imagem ocular para a câmera CCD. Defina os parâmetros de aquisição (por exemplo, tempo de exposição, ganho do detector e binning). Usando o software, adquira imagens Fura2-340 e Fura2-380 em repouso (começando com tempo de exposição idêntico para cada um, geralmente na faixa de ~ 200-1.000 ms).
         6. Use os métodos descritos na Etapa 5.4.1 para calcular o Fura2-340 / Fura2-380 para cada linfócito. Execute iterações repetidas de ajuste dos tempos de exposição Fura2-340 e Fura2-380, aquisição de imagens e cálculo de proporções até que os valores médios estejam próximos de 1.
      2. Defina os tempos de exposição para mem-YFP e DsRed.
         1. Substitua a placa de microscópio usada na etapa 5.3.3.1 por uma placa de microscópio contendo HLMVECs ou HDMVECs transfectados, ativados e tratados com SAg (ou não tratados; controle) da incubadora de cultura de células (Etapas 4.5.1). Use uma pipeta de transferência descartável para remover rapidamente o meio, enxágue uma vez a adição de ~ 1 ml de Buffer-A pré-aquecido. Aspire e adicione 0,5 ml de tampão-A.
         2. Identifique campos nos quais células endoteliais transfectantes positivas brilhantemente fluorescentes estão presentes e parecem saudáveis com junções intercelulares bem formadas.
         3. Ajuste os parâmetros de aquisição (por exemplo, tempo de exposição, ganho do detector e binning) para mem-YFP e DsRed. Certifique-se de que a intensidade média do sinal de fluorescência em cada canal esteja entre 25% e 75% da faixa dinâmica do detector.
4. Realize experimentos de imagem de células vivas.
   1. Use um software automatizado para iniciar a aquisição de imagens e capturar vários intervalos de imagens para estabelecer uma linha de base.
   2. Durante a aquisição, aplique ~ 5 μl de linfócitos concentrados carregados com Fura-2 (da etapa 5.2) no centro do campo de imagem da placa de microscópio, inserindo a ponta de uma pipeta de pequeno volume (P-5 ou P-20) no meio próximo ao centro da objetiva e ejetando lentamente.
   3. À medida que os linfócitos se instalam no campo de imagem, faça ajustes finos no foco para garantir que a interface célula T-célula endotelial (sinapses imunológicas) seja mantida no plano focal. Com objetivas de 40 e 63X, ~ 10-20 células por campo são ideais. Se forem observadas menos células no campo de imagem, repita a etapa 5.3.4.2.
   4. Após a conclusão do intervalo de observação desejado do experimento, continuar a geração de imagens e pipetar imediatamente a ionomicina diretamente na placa do microscópio (usando a técnica descrita em 5.3.4.2) até uma concentração final de 2 μM para induzir o fluxo máximo de cálcio / sinal de sinalização Fura-2 (ou seja, um meio de calibração, ver análise 5.4.).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bd Vacutainer stretch látex torniquete livre	BD Biociências	367203
Cotonetes com álcool BD	BD Biociências	326895
BD Vacutainer Safety-Lok	BD Biociências	367861	K2 EDTA
Conjunto de coleta de sangue com botão de pressão BD Vacutainer	BD Biociências	367335
RPMI-1640	Sigma-Aldrich	R8758-1L
Ficoll-Paque	Sigma-Aldrich	GE17-1440-02	Leve ao RT antes de usar
FCS-Optima	Biológicos de Atlanta	S12450	Inativado por calor
Penicilina-estreptomicina	Sigma-Aldrich	Pág. 4458-100ML
Azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154-20ML
Enterotoxina estafilocócica B	Tecnologia de toxinas	BT202RED	Solução estoque 1mg/ml em PBS
Toxina 1 da síndrome do choque tóxico	Tecnologia de toxinas	TT606RED	Solução estoque 1mg/ml em PBS
IL-15 humana	Sistemas de P&D	247-IL-025	Solução estoque 50ug / ml em PBS
Pbs	Tecnologias da Vida	Rolamento 10010-049
Fibronectina	Tecnologias da Vida	Rolamento 33016-015	Solução de estoque 1mg/ml em H20
Células endogênicas MV addérmicas HMVEC-d	Lonza	CC-2543	Outros CEs microvasculares humanos podem ser usados, ou seja, HLMVECs
Kit de bala EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich	T-4174	Solução estoque 10x, diluir em PBS
Kit Nucleofector Amaxa-HMVEC-L	Lonza	vpb1003	Kit necessário para a etapa 4
IFN-g	Sigma-Aldrich	I3265	Solução de estoque 1mg/ml em H20
TNF-alfa 10ug, humano	Tecnologias da Vida	PHC3015	Solução de estoque 1mg/ml em H20
HBSS sem vermelho de fenol	Tecnologias da Vida	14175-103
Hepes	Fisher Científico	BP299-100
Cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C1016-100G	Solução de estoque 1M em H20
Cloreto de magnésio	Sigma-Aldrich	208337	Solução de estoque 1M em H20
Albumina sérica humana	Sigma-Aldrich	A6909-10ml
Óleo de imersão sem fluorescência Immersol 518 F	Fisher Científico	12-624-66UMA
Fura-2 AM 20x50ug	Tecnologias da Vida	F1221	Solução de estoque 1mM em DMSO
pEYFP-Mem (Mem-YFP)	Clontech	6917-1
pDsRed-Monômero (DsRed citoplasmático solúvel)	Clontech	632466
Membrana de monômero pDsRed (Mem-DsRed)	Clontech	632512
pEGFP-Actina	Clontech	Nº 6116-1
Alexa Fluor 488 Faloidina	Tecnologias da Vida	A12379
Tubos de centrífuga cônicos Falcon 15mL	Fisher Científico	14-959-70C
Tubos de centrífuga cônicos Falcon 50mL	Fisher Científico	14-959-49A
Frascos tratados com cultura de tecidos Falcon T25	Fisher Científico	10-126-9
Frascos tratados com cultura de tecidos Falcon T75	Fisher Científico	13-680-65
Cultura de células Corning tratada com T175	Fisher Científico	10-126-61
Lamínulas de vidro	Fisher Científico	12-545-85	12 mm de diâmetro
Placas de cultura de tecidos Falcon de 24 poços	Fisher Científico	08-772-1
Placas Delta-T	Biotecnologias	04200415B
Pipetas Pasteur Descartáveis Wheaton	Fisher Científico	13-678-8D
Tubo Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Científico	05-402-25
ICAM1 camundongo anti-humano	BD Biociências	555509
HS1 camundongo anti-humano	BD Biociências	610541
CD11a anti-humano (LFA-1alfa) purificado	eBiociência	BMS102
CD3 Anti-Humano Alexa Fluor® 488	eBiociência	Telefone: 53-0037-41
Anticorpo anti-MHC Classe II	Abcam	AB55152
Anticorpo anti-talina 1	Abcam	AB71333
Anticorpo anti-PKC	Abcam	AB109481
Fosfotirosina (4G10 Platinum)	Millipore	Telefone: 50-171-463
Nucleofector II	Amaxa Biosystems		Eletroporador necessário para a etapa 4
Zeiss Axiovert	Carl Zeiss MicroImaging
Zeiss LSM510	Carl Zeiss MicroImaging
Software Zeiss Axiovison	Carl Zeiss MicroImaging
NU-425 (Série 60) Gabinete de Segurança Biológica	NuAIRE	Nº 425-600
Forma STRCYCLE 37 °C, 5% CO2 Incubadora de cultura de células	Fisher Científico	202370
Centrífuga 5810	Eppendorf	EW-02570-02
Hemocitômetro	Sigma-Aldrich	Z359629	Hemocitômetro Bright-Line
Banho de água Isotemp modelo 202	Fisher Científico	15-462-2