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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Modelo de camundongo transgênico do desenvolvimento do câncer de mama
- Observe os camundongos do modelo de câncer desejado para o crescimento apropriado do tumor por meio de palpação ou medição do paquímetro antes de prosseguir.
nota: Aqui, foi utilizado o modelo murino transgênico de desenvolvimento de câncer de mama (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT). Esses animais desenvolvem espontaneamente carcinomas de mama invasivos entre 6 e 12 semanas de idade em cada glândula mamária. Glândulas mamárias normais foram usadas como controles das irmãs de ninhada transgênicas negativas e pareadas por idade.
2. Injeção intravenosa de agentes de anticorpos específicos e inespecíficos
- Purifique os anticorpos de controle do isotipo B7-H3 e imunoglobulina G (IgG) de coelho em uma coluna de dessalinização (por exemplo, PD-10) para remover conservantes e tampões de armazenamento seguindo as instruções do fabricante.
nota: Alguns anticorpos podem precisar de purificação adicional com o protocolo baseado em esferas de agarose de proteína A.
- Dosagens alíquotas de 33 μg de cada conjugado de anticorpo em tubos individuais de microcentrífuga.
nota: A dosagem do agente administrado pode variar dependendo da aplicação e corresponde às dosagens nas quais o conjugado de anticorpos é usado rotineiramente. A concentração das soluções de anticorpos é necessária se o volume for superior a 100 μL para segurança animal.
- No momento desejado antes da coleta de tecido, aqui 96 h, anestesiar o animal portador do tumor com isoflurano a 2% fluindo em oxigênio a 2 L / min e colocá-lo em um estágio aquecido a 37 ° C. Faça uma pinça no dedo do pé para garantir que o nível adequado de anestesia foi atingido antes do procedimento.
- Para se preparar para a inoculação da veia da cauda das soluções de anticorpos, desinfete a cauda do animal limpando-a três vezes com um lenço umedecido com álcool. Dilate as veias da cauda aquecendo-as com uma almofada térmica por aproximadamente 30 segundos. Evite aquecer o animal inteiro. Limpe a cauda mais uma vez com um pano com álcool depois de remover a almofada térmica.
- Usando um cateter de veia da cauda 27G, insira a agulha borboleta em uma das duas veias laterais da cauda e fixe cuidadosamente a cauda com a agulha inserida no estágio com um pedaço de fita cirúrgica.
nota: O refluxo de sangue visível para o cateter indica a localização adequada da agulha dentro da veia da cauda.
- Lave o cateter com 25 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) e, em seguida, injete a solução de anticorpos no cateter usando seringas de insulina. Lave o cateter mais uma vez com 25 μL de PBS estéril.
- Remova a agulha da cauda e aplique pressão para parar qualquer sangramento.
- Desligue a anestesia e observe o animal até que esteja totalmente acordado para quaisquer sinais de angústia.
3. Coleta e preparação de tecidos tumorais alvo
- No momento desejado, eutanasiar humanamente o animal de acordo com o procedimento institucional aceitável, aqui, por inalação gradual de 100% de CO2 de um tanque de gás comprimido com uma taxa de fluxo de deslocamento da câmara de 10-30% volume/min.
nota: Algumas aplicações da técnica IVIL requerem eutanásia por perfusão cardíaca com PBS para remover anticorpos circulantes livremente.
- Após a confirmação da eutanásia humana por meio da cessação do movimento respiratório e cardíaco, falta de resposta ao pinçamento do dedo do pé e envelhecimento das membranas mucosas, excise os tecidos tumorais usando tesouras cirúrgicas e fórceps da seguinte forma:
- Coloque o mouse em decúbito dorsal e segurando apenas a camada externa da pele entre o conjunto de glândulas mamárias mais próximas da cauda (5ª) com uma pinça, faça uma pequena incisão com uma tesoura cirúrgica.
- Introduza a tesoura fechada no corte e abra lentamente a ponta para separar cuidadosamente a pele da membrana da parede abdominal subjacente, mantendo-a intacta.
- Faça uma incisão vertical no abdômen, continuando a separar a pele da membrana interna. Entre a 3ª e a 4ª glândulas mamárias, faça um corte horizontal no abdômen para permitir a retração da pele e a visualização das glândulas mamárias.
nota: Os tumores e glândulas mamárias estão localizados superficialmente sob a pele.
- Agarrando cada tumor ou glândula normal com uma pinça, corte cuidadosamente a pele anexada usando uma tesoura cirúrgica.
- Coloque os lenços excisados em moldes de base descartáveis de tecido, pré-rotulados e preenchidos com meio de incorporação de temperatura de corte ideal (OCT) e congele os moldes rapidamente colocando-os em gelo seco. Para estudar a entrega fora do alvo, excise outros tecidos ou órgãos de interesse (por exemplo, fígado ou pulmões).
nota: Para pausar o protocolo neste ponto, armazene blocos de tecido congelados a -80 °C até que esteja pronto para prosseguir.
- Usando um criostato, corte blocos de tecido congelado com 10 μm de espessura e coloque as seções adjacentes em lâminas de vidro de adesão pré-rotuladas.
nota: Para pausar o protocolo neste ponto, armazene as lâminas a -80 °C até que estejam prontas para prosseguir.
4. Protocolo de coloração ex vivo
NOTA: Para a comparação quantitativa entre imagens de microscopia de fluorescência, todas as lâminas são coradas ao mesmo tempo com as mesmas soluções preparadas.
- Enxágue as lâminas de tecido congeladas com PBS em temperatura ambiente por 5 min para remover a OCT.
- Demarque as seções de tecido com uma caneta barreira hidrofóbica para reduzir o volume de soluções necessárias durante a coloração.
nota: Tenha cuidado para não permitir que a caneta passe por cima das amostras de tecido, pois pode remover o tecido da lâmina ou impedir a coloração adequada na parte do tecido afetada. Não permita que as seções de tecido desidratem em nenhum momento.
- Fixe as seções de tecido com solução de paraformaldeído a 4% por 5 min.
- Enxágue as lâminas em PBS por 5 min.
- Permeabilize seções de tecido com 0,5% de Triton-X 100 em PBS por 15 min.
- Enxágue as lâminas em PBS por 5 min.
- Bloquear os tecidos com albumina de soro bovino (BSA) a 3% p/v e soro caprino a 5% v/v, ambos em PBS (solução bloqueadora) por 1 h em temperatura ambiente.
nota: Combine o soro da solução de bloqueio com o animal hospedeiro do anticorpo secundário.
- Enxágue as lâminas em PBS por 5 min.
- Incube seções com anticorpos primários de manutenção de registro, conforme desejado, possivelmente um marcador nuclear comum (por exemplo, DAPI), vascular (por exemplo, CD31) ou citoplasmático (por exemplo, actina). Aqui, o CD31 anti-camundongo de rato (marcador vascular) em uma diluição de 1:100 foi usado de acordo com as instruções do fabricante na solução de bloqueio durante a noite a 4 °C protegida da desidratação em uma bandeja de lâminas.
nota: Não adicione anticorpo primário adicional ou conjugado de anticorpos. O conjugado que foi injetado e se acumulou nos tecidos in vivo atua como o anticorpo primário.
- Enxágue as lâminas no PBS por 5 minutos três vezes, trocando o PBS a cada vez.
- Incube lâminas com anticorpos secundários para rotular anticorpos primários. Para esta aplicação, visualize o anticorpo anti-B7-H3 usando o anticorpo anti-coelho de cabra conjugado AlexaFluor-546 (diluição 1:200, otimizado de acordo com as instruções do fabricante) e CD31 com o anticorpo secundário anti-rato de cabra AlexaFluor-488 (diluição 1:200, otimizado de acordo com as instruções do fabricante) em solução de bloqueio, protegido da luz e da desidratação em uma bandeja de lâminas, por 1 h em temperatura ambiente.
nota: Os anticorpos secundários são do mesmo animal hospedeiro, mas correspondem à afinidade dos anticorpos secundários com a espécie hospedeira do respectivo anticorpo primário. Os slides são protegidos da luz a partir deste ponto.
- Enxágue as lâminas no PBS por 5 minutos três vezes, trocando o PBS a cada vez.
- Aplique uma gota do meio de montagem no centro da fatia de tecido e coloque cuidadosamente uma lamínula evitando o aprisionamento de bolhas de ar.
- Sele as bordas da lamínula com esmalte transparente e deixe secar.
nota: Para pausar o protocolo por até uma semana neste momento, armazene as lâminas a -20 ° C até que estejam prontas para prosseguir.
5. Imagem de microscopia confocal e análise quantitativa de imagens
NOTA: A preparação do microscópio confocal e dos parâmetros de imagem dependerá do sistema confocal usado. O microscópio usado aqui foi adquirido comercialmente (por exemplo, sistema Zeiss LSM 510 Meta) e o software de aquisição associado foi usado (por exemplo, Zen 2009). No entanto, muitas dessas etapas se aplicam a qualquer microscópio confocal e pressupõem conhecimentos básicos de microscopia confocal.
- Depois que o sistema for ligado e aquecido, selecione a objetiva desejada; aqui uma objetiva de 20x (abertura numérica = 0,8) foi usada.
- Carregue uma corrediça de controle positivo, com a lamínula para baixo, para permitir a configuração da otimização para o sinal mais brilhante. Imagem no canal vermelho, focalize o sistema na amostra no modo de imagem ao vivo.
- Para cada canal de laser usado, otimize a intensidade do laser, o ganho mestre e o tamanho do orifício da seguinte maneira:
- Mude para o modo Contínuo para geração de imagens.
- Otimize as barras deslizantes de Intensidade do Laser (que controla a potência do laser) e Ganho (Mestre) (que controla a tensão do tubo fotomultiplicador) enquanto monitora o histograma da Tabela de Pesquisa (LUT). Ajuste essas duas configurações até que a faixa dinâmica do histograma seja preenchida sem saturar pixels.
nota: Se a intensidade do laser for muito alta, ocorrerá fotobranqueamento. Se o Ganho (Mestre) for muito alto, a imagem ficará barulhenta. Idealmente, o Ganho (Mestre) estará no meio de seu intervalo.
- Defina o orifício para 1 unidade arejada (AU), que fornece a resolução mais alta e a fatia z mais fina.
- Deslize a barra de deslocamento digital para minimizar o nível de ruído no histograma LUT para obter um fundo preto verdadeiro.
nota: Depois que as configurações de microscopia forem otimizadas para cada canal e objetiva de laser, mantenha-as constantes durante toda a sessão de imagem e para a imagem de todas as lâminas, para permitir a comparação quantitativa entre as lâminas.
- Na guia Modo de aquisição, em Média, selecione o número e a profundidade de bits desejados. Clique no botão Ideal para definir o tamanho ideal do pixel.
- Use o botão de aquisição Snap para coletar uma imagem de alta qualidade. Aqui, campos de visão aleatórios foram selecionados de dentro do tumor, mas outras áreas de interesse podem ser aplicadas para diferentes aplicações (vasos, margens do tumor, profundidade de penetração, etc.)
- Salve os arquivos de imagem no formato usado pelo software confocal (aqui, ".lsm") para processamento e quantificação offline.
nota: Se nem todos os slides forem fotografados durante a mesma sessão, salve as configurações e recarregue-as em visitas subsequentes, embora não seja recomendável recriar a imagem do mesmo slide devido ao fotobranqueamento.
- Efectuar as medições quantitativas da intensidade de fluorescência. Abra Fiji (Fiji é apenas o software ImageJ) e carregue um arquivo de imagem .lsm arrastando-o para a barra de status.
- Divida os dados do canal de cores. Vá para Pilhas de > de imagem > Dividir canais.
- Pré-processe as imagens de fluorescência conforme necessário, ou seja, subtraia o sinal de fundo (Processar > Subtrair fundo) ou reduza o ruído por meio de um método de filtragem.
- Segmente o canal de cor correspondente à proteína de referência (coloração vascular, nuclear, celular) definindo um limite para a intensidade do sinal (Imagem > Ajustar > limite).
nota: O limite manual introduz subjetividade na análise de imagem, portanto, o uso de um algoritmo de limite automatizado ou a referência a histogramas de imagem tornam os resultados da análise de imagem menos tendenciosos.
- Use esse limite para criar uma máscara binária (Processo > Binário > Converter em Máscara).
- Meça e rotule os ROIs dentro da máscara (Analisar > Analisar Partículas > Marque Adicionar ao Gerenciador > OK).
- Aplique ROIs ao canal de cor correspondente ao anticorpo de interesse (Clique na imagem do canal, Analisar > Ferramentas > Gerenciador de ROI > Medir). Isso aplicará as ROIs da máscara à imagem do anticorpo e fornecerá medições de imagem para seções de rótulo na janela Resultados. Janela Salvar resultados (Arquivo > Salvar).
- Calcule a estatística de interesse desejada, como a intensidade média de fluorescência, conforme descrito aqui.
- Execute todas as etapas de processamento de forma idêntica a cada imagem em um conjunto de slides. Crie uma macro para fazer isso automaticamente para grandes lotes de imagens.
- Para exibição de imagem somente após medições quantitativas, aplique ajustes qualitativos de imagem para otimizar a visualização de padrões de biodistribuição, ajustando mínimo, máximo, brilho e contraste para os mesmos níveis em todos os slides (Imagem > Ajustar > Brilho/Contraste).
- Converta o tipo de imagem (Tipo de > de imagem > Cor RGB) e salve os arquivos em um tipo de imagem sem perdas, como .tiff (Arquivo > Salvar como > Tiff...) para uso em apresentações e publicações.