Um imunoensaio multiplex baseado em esferas para identificar anticorpos específicos de patógenos na saliva

Abstract

Fonte: Augustine, S. A. J., et al. Desenvolvendo um imunoensaio multiplex de anticorpos salivares para medir a exposição humana a patógenos ambientais. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra uma técnica de imunoensaio multiplex baseada em esferas para detectar simultaneamente anticorpos para vários patógenos ambientais na saliva humana. Grânulos fluorescentes foram acoplados a antígenos de diferentes patógenos, que foram capturados usando anticorpos na amostra de saliva humana. Ao marcar os anticorpos usando um repórter fluorescente, as esferas foram analisadas usando citometria de fluxo para avaliar a presença de diferentes anticorpos específicos do patógeno na saliva.

Protocol

1. Acoplamento de talão

1. Acople os antígenos aos conjuntos de esferas usando as concentrações mostradas na Tabela 1.
2. Adicionar cada antigénio às esferas ativadas e elevar o volume total para 500 μl em MES a 50 mM, pH 5,0. Misturar os antigénios e as esferas por vórtice.
3. Incubar os antígenos e grânulos por 2 horas com mistura por rotação (~ 15 rpm) à temperatura ambiente no escuro. Pellet os grânulos acoplados por microcentrifugação a 10.000 x g por 2 min.
4. Remova o sobrenadante e ressuspenda as esferas em 500 μl de solução salina tamponada com fosfato (PBS) - albumina de soro bovino (BSA) - monolaurato de polioxietileno sorbitano (Tween-20) - azida de sódio (PBS-TBN) pH 7,4 por vórtice e sonicação. Pulverize os grânulos por microcentrifugação a 10.000 x g por 2 min e remova o sobrenadante.
   cuidado: A azida de sódio é um produto químico agudamente tóxico. É fatal se ingerido ou entrar em contato com a pele. Não respire poeira/fumaça/gás/névoa/vapores ou spray. Use equipamento de proteção individual (EPI) apropriado ao manuseá-lo e descartá-lo de acordo com as leis apropriadas.
5. Ressuspender as esferas em 1 ml de PBS-TBN por vórtice e sonicação durante 20 segundos.
6. Pellet os grânulos por microcentrifugação a 10.000 x g por 2 min.
7. Repita as etapas 1.5 e 1.6.
   nota: Isso fornece um total de duas lavagens com PBS-TBN.
8. Ressuspenda os grânulos acoplados e lavados em 1 ml de PBS, 1% BSA, 0,05% de azida, pH 7,4. Armazene as contas acopladas em uma geladeira de 2 a 8 ° C no escuro.

2. Imunoensaio Multiplex Salivar

1. Retire a saliva do congelador a -80 °C e deixe-a descongelar à temperatura ambiente.
2. Ressuspenda os estoques de grânulos acoplados a antígenos por vórtice e sonicação por 20 segundos.
3. Prepare uma mistura de grânulos de trabalho diluindo os estoques de grânulos acoplados a uma concentração final de 100 grânulos / μl de cada conjunto de grânulos exclusivo em tampão PBS-1% BSA.
4. Prepare uma diluição de saliva de 1:4 com tampão PBS-1% BSA em uma placa de 96 poços profundos.
5. Umedeça previamente a placa filtrante com 100 μl de tampão de lavagem e remova o sobrenadante por vácuo.
6. Adicione 50 μl de uma mistura de esferas de trabalho e um volume igual de saliva diluída a 95 poços das placas filtrantes de 96 poços para uma diluição final de 1:8. Misture reações com um pipetador multicanal. Para um poço de controle, adicione 50 μl de grânulos acoplados a antígenos mais 50 μl de tampão PBS-1% BSA (como substituto da saliva).
7. Cubra e deixe incubar no escuro à temperatura ambiente por 1 hora em um agitador de microplacas a 500 rpm. Remova o sobrenadante por vácuo. Lavar os alvéolos com 100 μl de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por vácuo. Repita a lavagem 1x.
8. Ressuspenda os grânulos em 50 μl de PBS-1% BSA com um pipetador multicanal.
9. Anticorpo de detecção secundária anti-IgG humano de cabra biotinilado diluído a 16 μg/ml em PBS-1% BSA.
10. Adicione 50 μl de anticorpo secundário diluído a cada alvéolo e misture o conteúdo com um pipetador multicanal.
11. Cubra a placa filtrante e deixe-a incubar no escuro à temperatura ambiente por 30 min em um agitador de placas. Remova o sobrenadante por vácuo. Lavar os alvéolos com 100 μl de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por vácuo. Repita a lavagem 1x.
12. Ressuspenda os grânulos em 50 μl de PBS-1% BSA com um pipetador multicanal.
13. Diluir o repórter de estreptavidina-R-ficoeritrina (SAPE) a 24 μg/ml em PBS-1% BSA.
14. Adicione 50 μl de repórter a cada alvéolo e misture com um pipetador multicanal.
15. Cubra a placa filtrante e deixe-a incubar no escuro à temperatura ambiente por 30 min em um agitador de placas. Remova o sobrenadante por vácuo. Lavar os alvéolos com 100 μl de tampão de lavagem e remover o sobrenadante por vácuo. Repita a lavagem 1x.
16. Ressuspenda os grânulos em 100 μl de PBS-1% BSA e analise 50 μl usando o analisador.
    nota: Os resultados do imunoensaio multiplex são medidos em unidades de Intensidade Mediana de Fluorescência (MFI). Consulte sempre a versão mais recente do manual do software, se disponível, para evitar erros.

Tabela 1: Mistura de esferas de trabalho para o imunoensaio multiplex.Após a conclusão do acoplamento e da confirmação, uma mistura master consistindo em cada conjunto de contas foi preparada conforme mostrado. A mistura master foi distribuída entre todos os poços da placa de 96 poços. Todos os poços foram incubados com saliva, com exceção de um poço de controle de fundo que continha apenas grânulos e tampão PBS-1% BSA.

antígeno	Conjunto de contas	Amortecedor de acoplamento	Concentração de Ag (μg)	# de contas em 1 canto	# de grânulos/μl	Vol. para 100 B/uL para 4 ml (μl)
C. jejuni	8	MES 5.0	50	64	6.400	94
H. pylori	33	MES 5.0	25	71	7.100	85
Hepatite A	42	MES 5.0	100	91	9.100	66
T. gondii	30	MES 5.0	25	85	8.500	71
Norovírus GII.4	55	MES 5.0	5	72	7.200	83
Norovírus GI.1	67	MES 5.0	5	63	6.300	95
Desacoplado	80	MES 5.0		60	6.000	100
		Volume total de grânulos (μl)				594
		Volume total de tampão necessário (μl)				3.406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipamentos e Software
Microcentrífuga	Corporação Thermo Electron	75002446	Usado para centrifugar amostras
Misturador de vórtice	VWR	G560	Usado para misturar amostras
Sonicator (mini)	Fisher Científico	15-337-22	Usado para separar contas
Pipetadores P10, P20, P100, P1000, 8 ch.	Capp	vário
Coletor de vácuo multitela	Millipore	MSVMHTS00	Usado em etapas de lavagem para remover o sobrenadante
MicroShaker	VWR	12620-926	Usado para agitar grânulos durante as incubações
Suporte para tubos (1,5 mL e 0,5 mL) (sortidos)	VWR	Rolamento 30128-346
Balança	Mettler ou outro		Usado para medir reagentes de lavagem para fazer tampões
Misturador de amostras Dynabead	Invitrogen	947-01	Usado durante a etapa de incubação do acoplamento
MatLab (R2014b)	A MathWorks, Inc.		Usado para analisar dados de resposta de anticorpos
Microsoft Excel 2014	Corporação Microsoft		Usado para analisar dados de resposta de anticorpos
Analisador Luminex com software xPonent 3.1	Corporação Luminex	LX200-XPON3.1	Instrumento e software usados para executar o ensaio
Antígenos
GI.1 Vírus Norwalk : partícula p	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	* Hospital Infantil de Cincinnati. Concentração final 5 μg.
GII.4 Norovírus VA387 : p-partícula	Xi Jiang (CCHMC)*	NA	* Hospital Infantil de Cincinnati. Concentração final 5 μg.
Vírus da hepatite A : concentrado de grau II proveniente de cultura de células	Ciências da Vida Meridian	8505	Antigénio acoplado a 100 μg
Helicobacter pylori : lisado	Ciências da Vida Meridian	R14101	Antigénio acoplado a 25 μg
Toxoplasma gondii : p30 recombinante (SAG1)	Ciências da Vida Meridian	R18426	Antigénio acoplado a 25 μg
Campylobacter jejuni: células inteiras mortas pelo calor	KPL	Rolamento 50-92-93	Antigénio acoplado a 50 μg
Anticorpos Primários
Cobaia anti-norovírus	(CCHMC)*	NA	Usado para confirmação de acoplamento
Camundongo anti-hepatite A IgG	Ciências da Vida Meridian	C65885M	Usado para confirmação de acoplamento
Camundongo anti-hepatite A IgG	Ciências da Vida Meridian	C65885M	Usado para confirmação de acoplamento
Anticorpo purificado BacTraceAffinity para Helicobacter pylori	KPL	01-93-94	Usado para confirmação de acoplamento
PAb caprino para Toxoplasma gondii	Abcam	Ab23507	Usado para confirmação de acoplamento
BacTrace Caprino anti-Campylobacter	KPL	01-92-93	Usado para confirmação de acoplamento
Anticorpos secundários
Amide Conjugada com Biotina-SP Burro anti-Cabra IgG (H+L)	Jackson	705-065-149	Usado para confirmação de acoplamento
Coelho biotinilado anti-cabra IgG (H + L)	KPL	16-13-06	Usado para confirmação de acoplamento
IgG anti-rato de cabra biotinilada (H + L)	KPL	16-18-06	Usado para confirmação de acoplamento
A afinidade refinou a biotina do anticorpo rotulou a cabra anti-coelho IgG (H+L)	KPL	176-1506	Usado para confirmação de acoplamento
A afinidade refinou a biotina do anticorpo IgG anti-humano da cabra (γ)	KPL	16-10-02	Usado para imunoensaio salivar
Consumíveis
Tubos de microcentrífuga de copolímero de 1,5 mL	EUA Científico	1415-2500	Usado como tubos de microcentrífuga de baixa ligação
Recargas de ponteira de pipeta de 10 μL	BioVentures	5030050C
Recargas de ponteira de pipeta de 200 μL	BioVentures	5030080C
Recargas de ponteira de pipeta de 1000 μL	BioVentures	Rolamento 5130140C
Folha de alumínio	Vários fornecedores		Usado mantém as contas no escuro durante as incubações
Placas de poços profundos	VWR	40002-009	Usado para diluir amostras de saliva
Placas de filtro multitela	Millipore	MABVN1250	Usado para executar ensaios
Sistema de coleta de saliva Oracol	Desenvolvimentos Médicos Malvern Limitada		Usado para coleta de saliva
Reagentes
Microesferas carboxiladas (contas)	Corporação Luminex	Dependente do conjunto de contas	Os antígenos são acoplados às microesferas
EDC (cloridrato de 1-etil-3-[3dimetilaminopropil] carbodiimida)	furar	77149 ou 22980	Usado na ativação do cordão
Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)	furar	24510	Usado na ativação do cordão
Estetavidina-R-ficoeritrina (1mg/mL)	Sondas Moleculares	S-866	Usado como repórter
MES (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico)	sigma	M-2933	Usado para acoplamento
Tween-20 (monolaurato de polioxietilenoorbitano)	sigma	Pág. 9416	Usado no tampão de lavagem para remover ligações não específicas
Tampões de proteína
Tampão de bloqueio/armazenamento PBS-TBN (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% azida, pH 7,4)**			Filtre: Esterilize e armazene a 4 ° C
PBS, pH 7,4	sigma	Pág. 3813	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl
Bsa	sigma	A-7888	0,1% (p/v)
Interpolação-20	sigma	Pág. 9416	0,2% (v/v)
Azida de sódio (0,05% de azida)**	sigma	S-8032	**Cuidado: A azida sódica é agudamente tóxica. Evite o contato com a pele e os olhos. Use EPIs apropriados. Descarte de acordo com as leis aplicáveis.
MES/Tampão de acoplamento (0,05 M MES, pH 5,0)
MES (ácido 2-[N-morfolino]etanossulfônico)	sigma	S-3139
5 N NaOH	pescador	SS256-500
Tampão de ensaio (PBS, 1% BSA, pH 7,4)			Filtre: Esterilize e armazene a 4 ° C
PBS, 1% BSA, pH 7,4	sigma	Pág. 3688	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA
Tampão de ativação (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2)			Filtre: Esterilize e armazene a 4 ° C
NaH2PO4 (fosfato de sódio anidro monobásico)	sigma	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	pescador	SS256-500
Tampão de lavagem (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4)			Filtre: Esterilize e armazene a 4 ° C
PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4	sigma	Pág. 3563	138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN