Medição Quantitativa por Citometria de Fluxo de Fagocitose de Esporos Fúngicos por Fagócitos Humanos

Resumo

Fonte: Hartung, S., et al., Medindo a fagocitose de conídios de Aspergillus fumigatus por leucócitos humanos usando citometria de fluxo. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um método para quantificar a fagocitose de esporos de fungos patogênicos marcados com FITC por leucócitos humanos. Os esporos fagocitados são discernidos dos esporos aderentes às células por meio de contracoloração, seguida de análise por citometria de fluxo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Ensaio de fagocitose

1. Incubar 2 x 10⁶ leucócitos e 4 x 10⁶ conídios marcados com FITC (multiplicidade de infecção = 2) em 1,5 mL de RPMI + 10% FCS em uma placa de cultura de células de 12 poços. Como controles, inclua apenas células (sem conídios) e células + conídios não marcados.
2. Coloque em uma incubadora de CO₂ umidificada a 37 ° C e incube pelo período de tempo desejado (por exemplo, 0.5 h, 2 h ou 4 h).
3. Após a incubação, colha as célul....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Folha adesiva	marca	701367
Placa de cultura de células, 12 poços	Greiner Bio-one	Nº 665180
Citômetro	BD Biociências		LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (azul), 405 nm (violeta), 355 nm (UV) e 640 nm (vermelho)
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	2 mM em PBS
Isotiocianato de fluoresceína (FITC)	Sigma Aldrich	F3651-100MG	0,1 mM em solução de Na2CO3 /PBS
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	189012-014	Sem Cálcio, sem Magnésio
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	61870010	RPMI 1640 Médio, Suplemento GlutaMAX
Software para aquisição e análise de dados	BD Biociências
Placa de fundo em V, 96 poços	marca	781601	Superfície não tratada
Formaldeído	Carl Roth	PO87.3	Histofix