Medição Quantitativa por Citometria de Fluxo de Fagocitose de Esporos Fúngicos por Fagócitos Humanos

Resumo

Fonte: Hartung, S., et al., Medindo a fagocitose de conídios de Aspergillus fumigatus por leucócitos humanos usando citometria de fluxo. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra um método para quantificar a fagocitose de esporos de fungos patogênicos marcados com FITC por leucócitos humanos. Os esporos fagocitados são discernidos dos esporos aderentes às células por meio de contracoloração, seguida de análise por citometria de fluxo.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

1. Ensaio de fagocitose

1. Incubar 2 x 10⁶ leucócitos e 4 x 10⁶ conídios marcados com FITC (multiplicidade de infecção = 2) em 1,5 mL de RPMI + 10% FCS em uma placa de cultura de células de 12 poços. Como controles, inclua apenas células (sem conídios) e células + conídios não marcados.
2. Coloque em uma incubadora de CO₂ umidificada a 37 ° C e incube pelo período de tempo desejado (por exemplo, 0.5 h, 2 h ou 4 h).
3. Após a incubação, colha as células com um raspador de células e coloque em um tubo de 15 mL.
4. Gire por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente.
5. Colete sobrenadante para análise de citocinas ou descarte se não for desejado. Ressuspenda cada amostra em 100 μL de PBS + 2 mM EDTA.

2. Coloração de anticorpos

1. Para cada amostra, prepare 100 μL de mistura de anticorpos, incluindo o anticorpo APC anti-FITC, de acordo com a Tabela 1.
2. Coloque uma amostra de 100 μL em um poço de uma placa de fundo em V de 96 poços. Adicione 150 μL de PBS + 2 mM EDTA para lavagem.
3. Para compensação de cor, coloque 1 x 10⁶ células para cada cor em outros poços da placa inferior em V de 96 poços. Inclua um poço de células que não seja corado. Adicione 150 μL de PBS + 2 mM EDTA para lavagem.
4. Cubra o prato com uma folha adesiva.
5. Gire por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente. Remova o papel alumínio.
6. Descarte o sobrenadante invertendo a placa com rapidez e força apenas uma vez sobre a pia ou com uma toalha de papel descartável.
   NOTA: Não repita ou bata a placa em um papel até secar, pois isso resultará em uma perda maciça de células da placa.
7. Ressuspenda as células na mistura de anticorpos de 100 μL e misture bem por pipetagem.
8. Para compensação de cor, ressuspenda as respectivas células em 100 μL de PBS + 2 mM EDTA e adicione um único anticorpo a cada poço na mesma quantidade usada na mistura de anticorpos.
9. Cubra com uma folha adesiva e incube por 20 min em temperatura ambiente no escuro.
10. Remova o papel alumínio. Adicione 150 μL de PBS + 2 mM EDTA a cada poço para lavagem. Cubra com uma folha adesiva.
11. Gire por 5 min a 300 x g em temperatura ambiente. Remova o papel alumínio. Descarte o sobrenadante invertendo rápida e vigorosamente o prato sobre a pia ou uma toalha de papel descartável.
12. Ressuspenda em 200 μL de PBS + 2 mM de EDTA e transfira as células de cada poço para um tubo inferior redondo separado. Certifique-se de que não haja aglomerados de células na suspensão. Caso contrário, remova os clusters.
    NOTA: Cada aglomerado grande o suficiente para o olho ver é grande o suficiente para entupir o citômetro.

3. Citometria de fluxo

1. Ligue o citômetro de fluxo e deixe-o aquecer. Inicie o software de aquisição.
2. Crie um novo experimento e configure e rotule as amostras.
3. Configure parâmetros (FSC 250, SSC 250) e detectores para fluoróforos FITC, APC, BUV395, V500 e PerCP-Cy5.5.
4. Configuração de compensação
   1. Abra a configuração de compensação.
   2. Indique cores individuais.
   3. Usando as células de controle deixadas sem coloração ou com colorações individuais, defina as tensões do detector PMT para incluir todos os eventos dentro da escala.
   4. Registre pelo menos 10.000 eventos de cada controle.
   5. Use a configuração de compensação para calcular o transbordamento de fluoróforos e aplicá-lo às configurações do citômetro do experimento.
5. Registrando dados de amostra
   1. Exiba FSC e SSC no software de aquisição e defina uma porta ao redor dos leucócitos.
   2. Com base na porta leucocitária, exiba o gráfico de pontos SSC / CD45 e a porta para as células CD45 ⁺ se separarem dos conídios.
   3. Exiba as células CD45⁺ em um gráfico de pontos CD14/CD66b e monócitos porta (CD14⁺) e neutrófilos (CD66b⁺) separadamente.
   4. Exibir neutrófilos em um gráfico de pontos anti-FITC/FITC.
   5. Usando a amostra com conídios não marcados, defina quadrantes para sinais anti-FITC e FITC, permitindo um máximo de 1% de células nos respectivos quadrantes.
   6. Repita as etapas 3.5.4 e 3.5.5 para a porta de monócitos.
   7. Registre todas as amostras com pelo menos 20.000 eventos na porta leucocitária.

Tabela 1: Mistura de anticorpos para citometria de fluxo. As quantidades de cada reagente são dadas em microlitros por amostra (1 x 10⁶ células) a serem analisadas.

Reagente	μl por amostra
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0,5
CD66b PerCP-Cy5.5	1.5
APC anti-FITC	0,5
PBS + 2 mM EDTA	97
total	100

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Folha adesiva	marca	701367
Placa de cultura de células, 12 poços	Greiner Bio-one	Nº 665180
Citômetro	BD Biociências		LSR Fortessa II, lasers: 488 nm (azul), 405 nm (violeta), 355 nm (UV) e 640 nm (vermelho)
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)	Sigma Aldrich	ED3SS-500g	2 mM em PBS
Isotiocianato de fluoresceína (FITC)	Sigma Aldrich	F3651-100MG	0,1 mM em solução de Na2CO3 /PBS
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	ThermoFisher Scientific	189012-014	Sem Cálcio, sem Magnésio
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	61870010	RPMI 1640 Médio, Suplemento GlutaMAX
Software para aquisição e análise de dados	BD Biociências
Placa de fundo em V, 96 poços	marca	781601	Superfície não tratada
Formaldeído	Carl Roth	PO87.3	Histofix