Um ensaio de imunofluorescência para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos

Resumo

Fonte: Aulas, A. et al., Métodos para classificar focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos.J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra um ensaio para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos, que consistem em mRNAs, proteínas de ligação a RNA (RBPs) e várias outras proteínas.

Protocolo

1. Preparação da célula

1. Adicione lamínulas autoclavadas a 12 poços de uma placa de 24 poços, conforme indicado na Figura 1A; isso pode ser feito usando uma pipeta Pasteur estéril conectada a um vácuo para coletar cada lamínula. Bata suavemente na lamínula na lateral do poço para liberar a sucção, permitindo que a lamínula caia no poço.
2. Placa 1 x 10⁵ células de osteossarcoma U-2 OS (U2OS) por poço com um volume final de 500 μL de meio. Mova a placa de um lado para o outro e para cima e para baixo várias vezes para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente.
3. Pressione suavemente as lamínulas para baixo com uma ponta P1000 limpa para garantir que a lamínula esteja no fundo do poço e que não haja bolhas sob a lamínula.

2. Células de estresse

1. No dia seguinte, verifique visualmente a placa para garantir que as células estejam uniformemente dispersas e uniformemente confluentes na lamínula, pois as variações entre as amostras podem afetar adversamente a reprodutibilidade dos resultados. Use uma objetiva de 10X em um microscópio de cultura de tecidos invertido.
2. Pré-aqueça o meio a 37 °C. Evite aplicar meios frios ou quentes nas células, pois causam choque frio ou choque térmico, respectivamente.
3. Dilua os medicamentos em meios pré-aquecidos. Para cada concentração de medicamento diferente, prepare 2 poços contendo 500 μL de meio. Prepare mais 500 μL para permitir a perda durante a pipetagem. Alíquota 4 tubos, cada um contendo 1,5 mL.
   1. Para arsenito de sódio: a cada alvéolo contendo 500 μL, adicione 1,5 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 100 μM) ou adicione 0,75 μL de arsenito de sódio 100 mM (concentração final: 50 μM).
   2. Para vinorelbina: a cada alvéolo contendo 500 μL, adicione 22,5 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 150 μM) ou adicione 18,75 μL de vinorelbina 10 mM (concentração final: 100 μM).
      nota: O arsenito de sódio é um indutor de grânulos de tensão bem caracterizado e comumente usado e, portanto, é classicamente usado como controle positivo.
4. Remova e descarte o meio dos poços B1 - 4 e C1 - 4. Adicione a mídia com medicamentos e aguarde 60 minutos (Figura 1A).
   1. Adicione 500 μL de meio com 100 μM de arsenito de sódio aos poços B1 e B2. Adicionar 500 μL de meio com 50 μM de arsenito de sódio aos alvéolos B3 e B4.
   2. Adicionar 500 μL de meio com 150 μM de vinorelbina aos alvéolos C1 e C2. Adicionar 500 μL de meio com 125 μM de vinorelbina aos alvéolos C3 e C4.
5. 30 min antes da fixação, trate os alvéolos da coluna 2 com 5 μL de cicloheximida (estoque de 1 mg/mL) e os alvéolos da coluna 4 com 2 μL de puromicina (estoque de 1,25 mg/mL). Agite suavemente a placa para misturar antes de colocá-la de volta na incubadora a 37 °C.

3. Fixação Celular e Imunofluorescência

NOTA: Antes do experimento, certifique-se de que o metanol seja resfriado a -20 °C. Faça tampões, incluindo solução salina tamponada com fosfato (PBS), 5% de soro normal de cavalo (NHS) em PBS e 4% de paraformaldeído (PFA) em PBS.

1. Descarte a mídia e lave os poços contendo lamínulas com PBS. Dependendo dos medicamentos usados, pode ser importante descartar adequadamente os medicamentos que contêm mídia; Entre em contato com o escritório de segurança ambiental local para obter instruções específicas. Para lavar com eficiência, encha uma garrafa squeeze com PBS, corte a ponta para permitir um fluxo suave em vez de um fluxo apertado e use-o para adicionar PBS a cada poço após aspirar o PBS original.
2. Fixe as células usando ~ 250 μL de PFA a 4% por 15 min em temperatura ambiente, RT sob agitação suave. Cubra completamente a parte superior da lamínula com PFA; 250 μL deve ser suficiente, mas se não, adicione mais. Sempre evite pipetar diretamente nas lamínulas, pois algumas células (ou tratamentos de estresse das células) podem alterar a fixação e a força da pipetagem pode desalojar as células.
3. Remova o PFA e descarte corretamente. Entre em contato com o escritório de segurança ambiental local para obter detalhes sobre como descartar adequadamente o paraformaldeído.
4. Adicione ~ 250 μL de metanol (-20 ° C) e incube por 5 min em RT sob balanço suave; isso permeabiliza e achata as células.
5. Remova e descarte o metanol e bloqueie as células aplicando ~ 250 μL de NHS a 5% por 1 h em RT durante a noite, O / N, a 4 ° C. Entre em contato com o escritório de segurança ambiental local para obter detalhes sobre como descartar adequadamente o metanol.
6. Para anticorpos primários, dilua os anticorpos em 5% NHS.
   nota: O uso de vários marcadores SG é fundamental para confirmar se os grânulos observados são SGs genuínos. O número de marcadores SG que podem ser usados depende dos filtros disponíveis no microscópio. Se os conjuntos de filtros verde, vermelho e vermelho distante padrão estiverem disponíveis, use G3BP1, eIF4G e eIF3b em uma diluição de 1/250.
   1. Para este experimento (12 lamínulas a 250 μL cada - Total: 3 mL de 5% NHS), adicione 12 μL de cada um dos seguintes: anti-G3BP1, anti-eIF3b e anti-eIF4G. Incubar os anticorpos primários com agitação suave durante, pelo menos, 1 h a RT ou O/N a 4 °C.
7. Lave os poços 3x com PBS e incube cada lavagem por 5 min.
8. Para anticorpos secundários, dilua todos os anticorpos secundários (diluição de 1/250) e corante Hoechst (diluição de 1/1.000) em NHS a 5%.
   1. Para este experimento (12 lamínulas a 250 μL cada-Total: 3 mL de 5% NHS), adicione 12 μL de cada um dos seguintes: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit e Cy5-Goat (uma diluição de 1/250 de cada) e adicione 3 μL de corante Hoechst.
   2. Incubar as lamínulas com os anticorpos secundários durante 1 h à RT. Durante esta e as etapas seguintes, proteja as amostras da luz cobrindo a placa com uma caixa ou colocando papel alumínio por cima da placa de cultura de tecidos.
9. Lave os poços três vezes com PBS por 5 min cada.
10. Monte as lamínulas em lâminas de vidro rotuladas usando um meio de montagem. Aqueça o meio de montagem em um bloco de calor a 37 °C por 10 min; Isso diminui a viscosidade e facilita a pipeta. Com uma ponta P200 cortada, pipetar 25 μL de meio de montagem por lamínula em uma lâmina de vidro; 4-8 lamínulas podem caber em uma lâmina de vidro, supondo que o estágio do microscópio permita isso. Usando uma pinça fina, transfira a lamínula do poço para a lâmina, certificando-se de colocar o lado da célula para baixo no meio de montagem. Usando uma ponta P200 limpa, pressione a lamínula para baixo.
11. Depois que todas as lamínulas forem montadas, use tecido de laboratório dobrado para limpar o excesso de meio de montagem, pressionando o tecido de laboratório com muita firmeza na lâmina. Use um frasco de aperto contendo H₂O para lavar o excesso de meio de montagem e, em seguida, repita o borrão com tecido de laboratório dobrado para remover a água.

Resultados

Figura 1: Diagramas experimentais. (A) Semeie células em lamínulas previamente colocadas em uma placa de 24 poços, conforme indicado. Trate as linhas A e B por 60 min com SA ou VRB usando a concentração em μM conforme indicado. Após 60 min, adicione CHX (concentração final: 20 μg / mL para a coluna 2) ou puro (20 μg / mL de puromicina para a coluna 4) ao meio contendo o medicamento. ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema operacional U-2	ATCC	ATCC®HTB-96™	- comumente escrito como "U2OS" - cultura a 37 °C sob 5% de CO2 em 10% FBS/DMEM
Modificação de Dulbecco do Meio de Águia	Corning	10-013-CV	- abreviado DMEM - Contém 4,5 g/L de glicose, piruvato e vermelho de fenol - suplementado com 10% de FBS, HEPES 10 mM e penicilina/estetomicina - Pré-aqueça a diluição do(s) medicamento(s) anterior - diluição pré-quente antes do(s) medicamento(s)
Soro fetal bovino	sigma	F2442-500ml	- abreviado FBS - usado para complementar a mídia
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Científico	Rolamento 15630-080	- usado para complementar a mídia
Estreptomicina penicilina	sigma	P0781-100ml	- usado para complementar a mídia
Placa de 24 poços	Costar	3524
Tecidos de laboratório	CIÊNCIA KIMTECH	34120	- comumente chamados de "kimwipes"
Coverglass para Óculos de Cobertura de Crescimento	Fisher Científico	12-545-82	- Autoclavado antes de ser usado - manter estéril na capa de cultura de tecidos
(meta)arsenito de sódio ≥90%	sigma	S7400-100G	- comumente chamado de arsenito de sódio e abreviado SA - dissolução em água na concentração de 1 M e, em seguida, diluir a 100 μM como material de trabalho
Vinorelbina	TSZ CHEM	RS055	- abreviado VRB - dissolver em água a 10 mM
Puromicina	sigma	Pág. 9620	- usado para avaliar o nível de tradução (ribopuromicilação) - usado para avaliar a conexão do SG com a tradução ativa - diluir em água a 10 mg / mL
Hidrato de dicloridrato de emetina	sigma	E2375	- Usado em combinação com o Puro para avaliar o nível geral de tradução - usado para avaliar a conexão do SG com a tradução ativa - diluir em água a 10 mg / mL
Cicloheximida	sigma	C4859	- abreviado CHX - usado para avaliar a conexão do SG com a tradução ativa - diluir em água a 10 mg / mL
Solução salina tamponada com fosfato	Lonza / VWR	Rolamento 95042-486	- abreviado PBS - tampão de lavagem para imunofluorescência
Grau de reagente de paraformaldeído, cristalino	sigma	Rolamento P6148-500G	- faça uma solução a 4% em PBS quente na capela de exaustão, mexa até dissolver - as alíquotas podem ser armazenadas a - 20 °C por vários meses - perigoso, use ventilação - descarte em resíduos especiais
Metanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- pré-resfriado a -20 ° C antes do uso - descarte em resíduos especiais
Soro Normal para Cavalos	Thermo Fisher Científico	Rolamento 31874	- NHS abreviado - diluir para 5% em PBS - adicione azida de sódio para armazenamento a 4 ° C < br / > - solução de bloqueio para imunofluorescência
Etanol, puro, 200 provas (100%), USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	89125-188	- diluir a 70% com água
Lâminas de microscópio Fisherbrand Superfrost Plus	Marca de pescador	12-550-15
Anticorpo anti G3BP1 de camundongo (TT-Y)	Santa Cruz	SC-81940	- armazenar a 4 °C - use na diluição de 1/100
Anticorpo anti-eIF4G para coelhos (H-300)	Santa Cruz	SC-11373	- armazenar a 4 °C - Diluição de 1/250
Anticorpo anti-eIF3η (N-20) de cabra	Santa Cruz	SC-16377	- eIF3η também é conhecido como eIF3b - armazenar a 4 °C - Diluição de 1/250
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rato IgG (H+L)	Jackson Imunopesquisa	Rolamento 715-225-150	- reconstituir em água de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a 4 ° C < br / > - Diluição de 1/250
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Imunopesquisa	Rolamento 711-165-152	- reconstituir em água de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a 4 ° C < br / > - Diluição de 1/2500
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Imunopesquisa	Rolamento 705-175-147	- reconstituir em água de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a 4 ° C < br / > - Diluição de 1/250
Solução Hoechst 33258	sigma	94403-1ML	- incubar com anticorpos secundários - solução estoque 0,5 mg / mL em dH20, proteger da luz- Armazenar a 4 ° C
20 x tampão SSC	Thermo fisher Ambion	AM9763	- diluir para 2X SSC usando água livre de RNase (tratada com DEPC) - armazenar em temperatura ambiente - tampão de lavagem para PEIXES
Mídia de montagem deslizante	feito em casa	/	- misture 5 g de poli (álcool vinílico) "solúvel a frio" em 20 ml de PBS - misture por sonicação, seguido de agitação durante a noite em RT - Adicione 5 ml de glicerol e 0,2 ml de azida de sódio a 20% e mexa por 16 h em RT - centrifugação a 20.000 g por 20 min, descarte o líquido viscoso da alíquota de pellets grandes, armazenamento de longo prazo a -20 ° C, 1 semana a 4 ° C
Parafilme "M"	sigma	Pág. P7793-1EA	- geralmente referido como "parafilme"
Poli (álcool vinílico)	sigma	P-8136-250G	- reagente para fazer vinol
Glicerol	sigma	G5516-100ML	- reagente para fazer vinol
Azida de sódio	Fisher Científico	S2002-5G	- Agente conservante para solução bloqueadora e vinol - fazer uma diluição de 20 % em água