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Artigo de método
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8 de julho de 2025
Fonte: Aulas, A. et al., Métodos para classificar focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos.J. Vis. Exp. (2017)
Este vídeo demonstra um ensaio para caracterizar e quantificar grânulos de estresse de mamíferos, que consistem em mRNAs, proteínas de ligação a RNA (RBPs) e várias outras proteínas.
1. Preparação da célula
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Figura 1: Diagramas experimentais. (A) Semeie células em lamínulas previamente colocadas em uma placa de 24 poços, conforme indicado. Trate as linhas A e B por 60 min com SA ou VRB usando a concentração em μM conforme indicado. Após 60 min, adicione CHX (concentração final: 20 μg / mL para a coluna 2) ou puro (20 μg / mL de puromicina para a coluna 4) ao meio contendo o medicamento. .......
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema operacional U-2 | ATCC | ATCC®HTB-96™ | - comumente escrito como "U2OS" - cultura a 37 °C sob 5% de CO2 em 10% FBS/DMEM |
| Modificação de Dulbecco do Meio de Águia | Corning | 10-013-CV | - abreviado DMEM - Contém 4,5 g/L de glicose, piruvato e vermelho de fenol - suplementado com 10% de FBS, HEPES 10 mM e penicilina/estetomicina - Pré-aqueça a diluição do(s) medicamento(s) anterior - diluição pré-quente antes do(s) medicamento(s) |
| Soro fetal bovino | sigma | F2442-500ml | - abreviado FBS - usado para complementar a mídia |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher Científico | Rolamento 15630-080 | - usado para complementar a mídia |
| Estreptomicina penicilina | sigma | P0781-100ml | - usado para complementar a mídia |
| Placa de 24 poços | Costar | 3524 | |
| Tecidos de laboratório | CIÊNCIA KIMTECH | 34120 | - comumente chamados de "kimwipes" |
| Coverglass para Óculos de Cobertura de Crescimento | Fisher Científico | 12-545-82 | - Autoclavado antes de ser usado - manter estéril na capa de cultura de tecidos |
| (meta)arsenito de sódio ≥90% | sigma | S7400-100G | - comumente chamado de arsenito de sódio e abreviado SA - dissolução em água na concentração de 1 M e, em seguida, diluir a 100 μM como material de trabalho |
| Vinorelbina | TSZ CHEM | RS055 | - abreviado VRB - dissolver em água a 10 mM |
| Puromicina | sigma | Pág. 9620 | - usado para avaliar o nível de tradução (ribopuromicilação) - usado para avaliar a conexão do SG com a tradução ativa - diluir em água a 10 mg / mL |
| Hidrato de dicloridrato de emetina | sigma | E2375 | - Usado em combinação com o Puro para avaliar o nível geral de tradução - usado para avaliar a conexão do SG com a tradução ativa - diluir em água a 10 mg / mL |
| Cicloheximida | sigma | C4859 | - abreviado CHX - usado para avaliar a conexão do SG com a tradução ativa - diluir em água a 10 mg / mL |
| Solução salina tamponada com fosfato | Lonza / VWR | Rolamento 95042-486 | - abreviado PBS - tampão de lavagem para imunofluorescência |
| Grau de reagente de paraformaldeído, cristalino | sigma | Rolamento P6148-500G | - faça uma solução a 4% em PBS quente na capela de exaustão, mexa até dissolver - as alíquotas podem ser armazenadas a - 20 °C por vários meses - perigoso, use ventilação - descarte em resíduos especiais |
| Metanol, ACS | BDH / VWR | BDH1135-4LP | - pré-resfriado a -20 ° C antes do uso - descarte em resíduos especiais |
| Soro Normal para Cavalos | Thermo Fisher Científico | Rolamento 31874 | - NHS abreviado - diluir para 5% em PBS - adicione azida de sódio para armazenamento a 4 ° C < br / > - solução de bloqueio para imunofluorescência |
| Etanol, puro, 200 provas (100%), USP, KOPTEC | Decon Labs / VWR | 89125-188 | - diluir a 70% com água |
| Lâminas de microscópio Fisherbrand Superfrost Plus | Marca de pescador | 12-550-15 | |
| Anticorpo anti G3BP1 de camundongo (TT-Y) | Santa Cruz | SC-81940 | - armazenar a 4 °C - use na diluição de 1/100 |
| Anticorpo anti-eIF4G para coelhos (H-300) | Santa Cruz | SC-11373 | - armazenar a 4 °C - Diluição de 1/250 |
| Anticorpo anti-eIF3η (N-20) de cabra | Santa Cruz | SC-16377 | - eIF3η também é conhecido como eIF3b - armazenar a 4 °C - Diluição de 1/250 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rato IgG (H+L) | Jackson Imunopesquisa | Rolamento 715-225-150 | - reconstituir em água de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a 4 ° C < br / > - Diluição de 1/250 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Imunopesquisa | Rolamento 711-165-152 | - reconstituir em água de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a 4 ° C < br / > - Diluição de 1/2500 |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Imunopesquisa | Rolamento 705-175-147 | - reconstituir em água de acordo com as instruções do fabricante e armazenar a 4 ° C < br / > - Diluição de 1/250 |
| Solução Hoechst 33258 | sigma | 94403-1ML | - incubar com anticorpos secundários - solução estoque 0,5 mg / mL em dH20, proteger da luz- Armazenar a 4 ° C |
| 20 x tampão SSC | Thermo fisher Ambion | AM9763 | - diluir para 2X SSC usando água livre de RNase (tratada com DEPC) - armazenar em temperatura ambiente - tampão de lavagem para PEIXES |
| Mídia de montagem deslizante | feito em casa | / | - misture 5 g de poli (álcool vinílico) "solúvel a frio" em 20 ml de PBS - misture por sonicação, seguido de agitação durante a noite em RT - Adicione 5 ml de glicerol e 0,2 ml de azida de sódio a 20% e mexa por 16 h em RT - centrifugação a 20.000 g por 20 min, descarte o líquido viscoso da alíquota de pellets grandes, armazenamento de longo prazo a -20 ° C, 1 semana a 4 ° C |
| Parafilme "M" | sigma | Pág. P7793-1EA | - geralmente referido como "parafilme" |
| Poli (álcool vinílico) | sigma | P-8136-250G | - reagente para fazer vinol |
| Glicerol | sigma | G5516-100ML | - reagente para fazer vinol |
| Azida de sódio | Fisher Científico | S2002-5G | - Agente conservante para solução bloqueadora e vinol - fazer uma diluição de 20 % em água |
