Um ensaio para avaliar a fagocitose e a atividade de explosão oxidativa em granulócitos e monócitos

Resumo

Fonte: Meaney, M. P. et al., Medindo fagocitose de granulócitos e monócitos e atividade de explosão oxidativa no sangue humano. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o ensaio para confirmar a atividade fagocítica das células no sangue humano por meio da citometria de fluxo. Os granulócitos e monócitos confirmam sua atividade fagocítica mostrando fluorescência verde e vermelha, confirmando a presença de bactérias engolfadas e atividade de explosão oxidativa, respectivamente.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Preparação do ensaio

1. Reúna, prepare e organize os materiais especificados para o procedimento (consulte a Tabela de Materiais/Equipamentos Específicos).
   1. Rotule os tubos de 12 x 75 mm.
      1. Rotule dois tubos para cada participante: um tubo para o ensaio de fagocitose (rotule este tubo com tinta preta e um "F" para isotiocianato de fluoresceína [FITC]) e um....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de 12 x 75 mm, com tampa	VWR	20170-579	Você precisará de 2 tubos por amostra ("H" e "F") mais 3 tubos por lote (para controles de ensaio; "F", "H" e "Somente sangue").
PBS (10X), pH 7,4	Tecnologias da Vida	Rolamento 70011-044
Filtro de acetato de celulose de 0,2 μm na tampa do frasco (capacidade de 500 ml)	Fisher Científico	09-741-07
Glicose em pó	Tecnologias da Vida	15023-021
Ácido cítrico (anidro, cultura de células testada, cultura de células vegetais testada)	Sigma-Aldrich	C2404-100G
Citrato de sódio tribásico di-hidratado	Sigma-Aldrich	S4641-25G
Dihidroetídio (Hidroetidina) (HE)	Tecnologias da Vida	D11347
Dimetilsulfóxido (DMSO) anidro	Tecnologias da Vida	D12345
Staphylococcus aureus (cepa de madeira sem proteína A) BioPartículas conjugadas de fluoresceína (FITC)	Tecnologias da Vida	S2851
Staphylococcus aureus (cepa de madeira sem proteína A) Biopartículas, não rotuladas	Tecnologias da Vida	S-2859
Solução de Azul de Tripano, 0,4%	Tecnologias da Vida	Rolamento 15250-061
4,0 ml de vacutainer contendo 7,2 mg de K2EDTA, seco por pulverização	VWR	BD367861	Você precisará de 1 tubo de coleta de sangue K2 EDTA por amostra.
Aspirador de 4,0 mL contendo 68 unidades USP Heparina de lítio, revestida por spray	VWR	BD367884	Você precisará de 1 tubo de coleta de sangue de heparina de lítio por amostra.
RELHA AC·T 5diff CP	Beckman Coulter	6605705	ou seja, analisador de hematologia
RELHA Ac·T 5diff Enxágue	Beckman Coulter	8547167
Correção COULTER Ac·T 5diff	Beckman Coulter	8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC Lyse	Beckman Coulter	8547170
RELHA AC·T 5diff Hgb Lyse	Beckman Coulter	8547168
Calibrador de Cal COULTER Ac·T 5diff	Beckman Coulter	7547175
COULTER Ac·T 5diff Control Plus	Beckman Coulter	7547198
Diluente AcT 5diff	Beckman Coulter	8547169
Ponteiras de pipeta de comprimento estendido de 200 μL	VWR	Rolamento 37001-526
Panela de gelo isolada	VWR	89198-980	Para banho de água gelada.
Rack de tubo de metal aberto	VWR	Nº 60916-702
Soro fetal bovino	Tecnologias da Vida	Rolamento 26140-111
Estação de trabalho TQ-Prep	Beckman Coulter	6605429	ou seja, estação de trabalho automatizada de preparação de lise celular
Sistema de reagentes ImmunoPrep	Beckman Coulter	7546999	ou seja, sistema de reagente de correção de lise de RBC/WBC
RELHA CLENZ	Beckman Coulter	8546929