Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Preparação do ensaio
- Reúna, prepare e organize os materiais especificados para o procedimento (consulte a Tabela de Materiais/Equipamentos Específicos).
- Rotule os tubos de 12 x 75 mm.
- Rotule dois tubos para cada participante: um tubo para o ensaio de fagocitose (rotule este tubo com tinta preta e um "F" para isotiocianato de fluoresceína [FITC]) e um tubo para o ensaio de atividade de explosão oxidativa (OB) (rotule este tubo com tinta vermelha e um "H" para dihidroetídio [HE]).
nota: Recomenda-se o uso de tubos estéreis de 12 x 75 mm para minimizar a ativação celular não intencional e o aumento associado do ruído de fundo.
- Rotule três tubos para os controles do ensaio: um tubo para o ensaio de fagocitose (controle FITC: rotule este tubo com tinta preta e um "F"), um tubo para o ensaio de atividade OB (controle HE: rotule este tubo com tinta vermelha e um "H") e um tubo para o controle negativo (somente sangue: rotule este tubo com tinta verde e "somente sangue").
- Preparar soluções-mãe pelo menos um dia antes do dia do ensaio.
- Prepare a solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Diluir 100 ml de PBS 10x com 900 ml de 18,2 MΩ H2O. Esterilizar o filtro com um filtro de 0,2 μm. Conservar a 4 °C até à utilização.
- Prepare a glicose PBS estéril. Dissolva 1,0 g de glicose em 100 ml de PBS. Esterilize o filtro com um filtro de 0,2 μm. Conservar a 4 °C até à utilização.
- Prepare o tampão estéril de citrato 0,1 M. Dissolver 1,2 g de ácido cítrico e 1,1 g de citrato de sódio em 100 ml de 18,2 MΩ H2O. Ajustar o pH a 4,0. Esterilize o filtro com um filtro de 0,2 μm. Conservar a 4 °C até à utilização.
- Preparar a solução-mãe HE. Ressuspenda 1,0 mg de HE em 1,0 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Misturar delicadamente, alíquota e conservar a -20 °C até à utilização.
- Preparar a solução-mãe de Staphylococcus aureus (S. aureus) marcada com FITC (2 x 10,9 partículas/ml). Ressuspenda 10 mg de S. aureus marcado com FITC em 1,5 ml (ou quantidade apropriada) de PBS. Divida em três alíquotas de 500 μl e sonice de acordo com a recomendação do fabricante. Alíquota e conservar a -20 °C até à utilização.
- Preparar a solução-mãe de S. aureus não marcada (2 x 109 partículas/ml). Ressuspenda 100 mg de S. aureus não rotulado em 15 ml (ou quantidade apropriada) de PBS. Divida em trinta alíquotas de 500 μl e sonice de acordo com a recomendação do fabricante. Alíquota e conservar a -20 °C até à utilização.
- Prepare novas soluções de trabalho no dia do ensaio.
- Prepare a solução de trabalho HE. Transferir 10 μl da solução-mãe de HE descongelada para 990 μl de PBS-glicose. Proteja da luz e mantenha no gelo até o uso.
- Preparar a solução de trabalho de S. aureus marcada com FITC (133.333 partículas/μl). Transfira 70 μl de solução estoque de S. aureus descongelada marcada com FITC para 980 μl de PBS. Proteja da luz e mantenha no gelo até o uso.
- Preparar a solução de trabalho de S. aureus não marcada (133.333 partículas/μl). Transferir 70 μl de solução-mãe de S. aureus descongelada não marcada para 980 μl de PBS. Proteja da luz e mantenha no gelo até o uso.
- Prepare a solução de têmpera. Adicione 750 μl de solução de azul de tripano a 0,4% a 11,25 ml de tampão citrato estéril 0,1 M. Conservar em banho de água gelada até à utilização.
- Peça a um flebotomista certificado que tire sangue de acordo com as diretrizes da Organização Mundial da Saúde para tirar sangue.
- Aspirar o sangue para um tubo de colheita de sangue de 4 ml contendo ácido etilenodiaminotetracético dipotássico (K2EDTA). Inverta o tubo de coleta de sangue de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha o tubo de coleta de sangue em temperatura ambiente em uma cadeira de balanço de bancada até o uso. Use este sangue para o hemograma completo (CBC) com análise diferencial de glóbulos brancos (WBC) descrita na Etapa 1.2.1.
- Retire o sangue para um tubo de coleta de sangue de 4 ml contendo heparina de lítio. Inverta o tubo de coleta de sangue de acordo com as instruções do fabricante. Mantenha o tubo de coleta de sangue em temperatura ambiente (RT) em uma cadeira de balanço de bancada até o uso. Use este sangue para a fagocitose de monócitos e granulócitos e ensaio de atividade OB descrito na Etapa 2.
- Determine a quantidade de bactérias (ou seja, S. aureus) que será necessária para completar o ensaio para cada amostra.
- Use um analisador hematológico para realizar um hemograma completo com análise diferencial de leucócitos no sangue, conforme descrito nas instruções do fabricante. Anote os valores da contagem leucocitária (em células/ml), % de neutrófilos e % de monócitos.
- Use as equações abaixo para determinar as contagens de neutrófilos e monócitos para cada amostra.
Contagem de neutrófilos (em células/ml) = %Neutrófilos × leucócitos (em células/ml)
Contagem de monócitos (em células/ml) = %Monócitos × leucócitos (em células/ml)
- Use as equações abaixo para determinar a contagem de fagócitos para cada amostra e o número de fagócitos presentes em 100 μl da amostra.
Contagem de fagócitos (em células/ml) = Contagem de neutrófilos (em células/ml) + Contagem de monócitos (em células/ml)
Número de fagócitos em 100 μl = (Contagem de fagócitos (em células/ml))/10
- Use a equação abaixo para determinar o número de bactérias (ou seja, S. aureus) necessárias para cada amostra e a quantidade de S. aureus marcado com FITC ou solução de trabalho de S. aureus não marcada (133.333 partículas/ml) que deve ser adicionada a cada tubo.
nota: A relação bactéria-alvo: fagócito é de 8:1.
Número de bactérias necessárias = Número de fagócitos em 100 μl × 8
Volume de FITC ou solução de trabalho não rotulada necessária (em μl) = (número de bactérias necessárias)/(133.333 partículas/μl)
2. Realizar ensaio
- Prepare sangue total para o ensaio.
- Para cada participante e tubo de controle, use uma ponta de pipeta de comprimento estendido para transferir 100 μl de sangue total do tubo de coleta de sangue de heparina de lítio para o fundo de um tubo de 12 x 75 mm devidamente rotulado. Substitua caps.
nota: Tenha cuidado para evitar que haja sangue nas laterais dos tubos de 12 x 75 mm.
- Use uma micropipeta para adicionar 10 μl de solução de trabalho HE aos tubos marcados com tinta vermelha e um "H", incluindo o tubo de controle HE. Substitua as tampas e o vórtice brevemente.
- Incubar todos os tubos em banho-maria a 37 °C durante 15 min. Em seguida, transfira imediatamente todos os tubos para um banho de água gelada por 12 min.
nota: Use um rack de metal aberto e agite suavemente o rack a cada 5 minutos para garantir que os tubos sejam aquecidos ou resfriados de forma rápida e adequada.
- Adicione bactérias (ou seja, S. aureus) à amostra e aos tubos de controle.
- Use uma micropipeta para adicionar a quantidade apropriada (calculada na Etapa 1.2.4) de solução de trabalho de S. aureus não marcada aos tubos marcados com tinta vermelha e um "H", incluindo o tubo de controle HE. Substitua as tampas e o vórtice brevemente.
- Use uma micropipeta para adicionar a quantidade apropriada (calculada na Etapa 1.2.4) de solução de trabalho de S. aureus marcada com FITC aos tubos marcados com tinta preta e um "F", incluindo o tubo de controle FITC. Substitua as tampas e o vórtice brevemente.
- Vortex o tubo de controle "somente sangue", mas não adicione nenhum tipo de bactéria (ou seja, S. aureus) a ele.
- Incube todos os tubos em banho-maria a 37 °C por 20 min. Use um rack de metal aberto e agite suavemente o rack a cada 5 min para garantir que os tubos sejam aquecidos de forma rápida e adequada. Após o período de incubação, transfira imediatamente todos os tubos para um banho de água gelada por 1 min.
- Lave as células.
- Use uma pipeta repetidora para adicionar 100 μl de solução de têmpera gelada a todos os tubos. Recoloque as tampas, vortex brevemente e, em seguida, incube todos os tubos no gelo por 1 min.
- Use uma pipeta repetidora para adicionar 1 ml de PBS gelado a todos os tubos. Vortex brevemente e, em seguida, adicione mais 2 ml de PBS gelado a todos os tubos e recoloque as tampas. Centrifugar todos os tubos durante 5 min a 4 °C e 270 x g e, em seguida, aspirar o sobrenadante.
- Repita a Etapa 2.3.2 uma vez (total de 2 lavagens).
- Prepare amostras para citometria de fluxo.
- Use uma pipeta repetidora para adicionar 50 μl de soro fetal bovino gelado a todos os tubos. Brevemente vórtice todos os tubos.
- Transfira todos os tubos para um carrossel apropriado e use uma estação de trabalho automatizada de preparação de lise celular com lise de glóbulos vermelhos (RBC) e reagentes de fixação de leucócitos para lisar os RBCs e fixar os WBCs conforme descrito nas instruções do fabricante.
