Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Configuração experimental
- Use folhas de papel de filtro (folhas de poliéster hidroxilado fibroso, consulte a Tabela de Materiais).
- Recorte tiras de 3 x 15 mm de tamanho para uma criança de 1 mês e em forma de L para crianças mais velhas e adultos (5 x 20 x 10 mm (braço curto do L)).
- Insira um pedaço de papel de filtro em cada narina de um bebê usando uma pinça. Coloque o papel de filtro na parte anterior do corneto inferior (aproximadamente 1 cm dentro da narina para neonatos e 1,5 cm para todas as outras idades).
- Coloque os recém-nascidos em uma cama e dê-lhes água com açúcar para maior conforto.
nota: Para crianças de todas as outras idades, a amostragem é realizada mais facilmente com o sujeito sentado em uma cadeira.
- Para crianças mais velhas, insira o braço longo do papel de filtro em forma de L em cada narina.
- Aplique um clipe nasal ao redor das narinas para minimizar o desconforto e evitar a perda acidental do papel de filtro.
- Remova os papéis de filtro após 2 min de absorção.
- Coloque os papéis de filtro em tubos rotulados e congele-os imediatamente a -80 °C.
- Anote quaisquer sintomas de infecção das vias aéreas apresentados pela criança no dia da amostragem.
- Registre qualquer espirro, choro persistente ou epistaxe que ocorra durante os 2 minutos de amostragem.
2. Quantificação de mediadores imunológicos das vias aéreas
- Retire até 10 amostras aleatórias do freezer. Registre os números de identificação. Mantenha as amostras no gelo durante todo o processo de trabalho.
- Após descongelar no gelo, mergulhe os papéis de filtro (por sujeito) de ambas as narinas em 300 μL de tampão recém-preparado (consulte a Tabela de Materiais) contendo um comprimido inibidor de protease completo (consulte a Tabela de Materiais) por 25 mL de tampão.
- Ajuste o volume do buffer de acordo com o tamanho do papel de filtro.
- Use 300 μL de tampão para papéis de filtro de 3 x 15 mm de tamanho.
- Se apenas um papel de filtro estiver disponível, use metade do volume do tampão (150 μL).
- Transfira as amostras para um agitador de placas (400 rpm) por 5 min. Use um temporizador.
- Transfira os papéis de filtro úmidos e o tampão de ensaio para o copo de um filtro de tubo de acetato de celulose (tamanho de poro de 0,22 μm) colocado dentro de um tubo de microcentrífuga (consulte a Tabela de Materiais).
- Centrifugue a 16.000 x g por 5 min em uma centrífuga resfriada (a 4 ° C) para obter extrato nasal filtrado no tubo.
- Remova o copo e mantenha os tubos no gelo enquanto alíquota do extrato nasal nos poços das placas de armazenamento de baixa ligação de proteínas (consulte a Tabela de Materiais).
- Conservar a -80 °C até à análise.
- Determinar as concentrações de citocinas e quimiocinas nos extratos nasais usando um sistema multiplexado de alta sensibilidade, baseado em eletroquimioluminescência (consulte a Tabela de Materiais).
c: Um ensaio de citocina 10-plex TH1 / TH2 humano, ensaio de quimiocina 9-plex e interleucina-17A de plex único (IL-17A), fator de crescimento transformador-beta1 (TGF-β1) e linfopoietina estromal tímica (TSLP) foram realizados aqui.
- Para os ensaios, incubar os extratos nasais durante a noite a 4 °C. Realizar as medições de acordo com o protocolo padrão do fabricante (ver Tabela de Materiais).
nota: Os imunoensaios (consulte a Tabela de Materiais) normalmente têm uma alta faixa dinâmica para medição variando entre 1 e 10.000 pg / mL, mas para alguns ensaios, pode ser de 100.000 pg / mL. Isso significa que todas as amostras podem ser executadas na mesma diluição, limitando assim a influência de diluições diferentes em indivíduos saudáveis e doentes, como é o caso em outros imunoensaios semelhantes. O limite inferior de detecção para todas as citocinas foi de 1 pg / mL ou menos, e para quimiocinas, variou entre 1 e 50 pg / mL. O TSLP não foi detectável em 98% das amostras com 1 mês de idade.
