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1. Projetando e preparando os peptídeos
- Adquira a sequência da proteína de fusão de interesse de um banco de dados público, como o NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou o banco de dados de patógenos virais (https://www.viprbrc.org). Escolha o local de reconhecimento da protease que precede o peptídeo de fusão e inclua 2-3 aminoácidos a montante e a jusante desta sequência.
- Ao solicitar os peptídeos, modifique-os com o par FRET 7-metoxicumarina-4-il-acetil (MCA) no terminal N e N-2,4-dinitrofenil (DNP) no terminal C.
nota: Vários fornecedores fornecem essas modificações. O preço e o prazo de entrega dependem do fornecedor escolhido. No entanto, existem modificações alternativas que variam em sensibilidade e requerem ajustes do leitor de placas em termos de comprimentos de onda.
- Ressuspenda o peptídeo de acordo com as recomendações do fabricante, pipetando-o suavemente para cima e para baixo. Por exemplo, ressuspenda peptídeos em etanol a 70% até a concentração final de 1 mM.
- Opcionalmente, adicione o tubo contendo o peptídeo e o solvente em um banho de sonicação até que seja totalmente ressuspenso se o peptídeo não ressuspender muito bem por pipetagem.
- Alicote o peptídeo em tubos de amortecimento de luz ou resistentes para proteger o peptídeo do branqueamento. Mantenha as alíquotas pequenas para evitar vários ciclos de congelamento/descongelamento (por exemplo, 100 μL). Armazene alíquotas a -20 ° C.
2. Preparando o leitor de placa de fluorescência
- Ligue o leitor de placas e aguarde até que o autoteste seja concluído.
- Abra o software operacional no computador conectado e certifique-se de que ele esteja conectado ao leitor de placas.
- Abra a configuração de temperatura e ajuste-a para 30 °C (ou a temperatura necessária para um desempenho ideal para a protease).
- Clique em Controle | Configuração do instrumento para configurar o experimento.
- Escolha Cinético.
- Selecione Fluorescência.
- Insira os comprimentos de onda de excitação e emissão: 330 nm e 390 nm, respectivamente.
- Desmarque Corte automático.
- Selecione Média, sensibilidade normal.
- Escolha um tempo de execução de 1 h para o ensaio e selecione uma medição a cada 60 s.
- Defina 5 s de mistura antes da primeira medição e 3 segundos antes de cada medição
- Selecione poços para ler e iniciar o ensaio.
3. Preparando o ensaio
- Prepare o tampão de ensaio calculando as quantidades apropriadas para cada ingrediente e adicionando-o. Para furina, faça um tampão consistindo de 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-mercaptoetanol e 5% Triton X-100. Para tripsina, use solução salina tamponada com fosfato (PBS) padrão.
nota: Volumes de 10 mL ou menos são suficientes. Dependendo da(s) protease(s) usada(s) no ensaio, o tampão varia.
- Resfrie o tampão no gelo.
- Coloque a placa de ensaio no gelo com uma placa de metal fina embaixo para apoiar o resfriamento e a estabilidade. Use uma placa de poliestireno preto sólido de 96 poços com fundo plano e não tratada.
nota: É essencial usar placas pretas para evitar "vazamentos" fluorescentes de poços adjacentes.
- Calcule a quantidade apropriada de protease a adicionar para cada reação com base em publicações anteriores ou dados experimentais. Para furina, use 1 unidade por reação que corresponde a 0,5 μL. Para tripsina, use 0,5 μL de tripsina TPCK 160 nM.
- Por amostra, preparar 3 réplicas técnicas por ensaio em um volume total de 100 μL por amostra.
nota: Avaliou-se experimentalmente que não faz diferença se a pipetagem é realizada em condições normais de luz ou luz fraca. No entanto, os peptídeos não devem ser expostos à luz por um longo período de tempo.
- Pipetar a quantidade adequada de tampão de ensaio (94,5 μL conforme descrito no Passo 3.1) em cada alvéolo.
- Adicione a protease a cada poço. Para ambos, furina e tripsina TPCK, use 0,5 μL por amostra. Para 6 poços (3 poços para um controle em branco e 3 poços para um controle peptídico), adicione 0,5 μL de tampão em vez da respectiva protease.
- Adicionar o peptídeo a uma concentração final de 50 μM em cada alvéolo, excepto no controlo em branco. Nesse caso, a pipeta de peptídeo de 5 μL foi preparada conforme descrito na Etapa 1.3. Adicione 5 μL de tampão ao controle em branco em vez de peptídeo.
nota: Várias concentrações do peptídeo foram inicialmente testadas com as concentrações enzimáticas descritas para garantir que as enzimas estivessem saturadas.
- Insira a placa no leitor de placa de fluorescência e clique em iniciar.