Um ensaio de clivagem de peptídeos fluorogênicos para rastrear a atividade proteolítica de proteases

Abstract

Fonte: Jaimes, J. A., et al. Um ensaio de clivagem de peptídeo fluorogênico para rastrear a atividade proteolítica: aplicações para ativação da proteína spike do coronavírus. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um ensaio para rastrear a atividade proteolítica de proteases usando peptídeos fluorogênicos. A protease reconhece seu local de clivagem no peptídeo, clivando-o e separando o supressor do fluoróforo, permitindo sua emissão de fluorescência. O sinal de fluorescência é detectado e analisado para verificar a eficiência de clivagem de diferentes variantes de peptídeos.

Protocol

1. Projetando e preparando os peptídeos

1. Adquira a sequência da proteína de fusão de interesse de um banco de dados público, como o NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ou o banco de dados de patógenos virais (https://www.viprbrc.org). Escolha o local de reconhecimento da protease que precede o peptídeo de fusão e inclua 2-3 aminoácidos a montante e a jusante desta sequência.
2. Ao solicitar os peptídeos, modifique-os com o par FRET 7-metoxicumarina-4-il-acetil (MCA) no terminal N e N-2,4-dinitrofenil (DNP) no terminal C.
   nota: Vários fornecedores fornecem essas modificações. O preço e o prazo de entrega depen....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peptídeos	Biomatik	N/A
Furin	Neb	Pág. 8077S
Tripsina tratada com TPCK	Sigma-Aldrich	4352157-1KT
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
Tritão-X100	Sigma-Aldrich	100 X
Pbs	Corning	21-040-CV
SpectraMax Gemini XPS	Dispositivos Moleculares	Porta XPS
SoftMax Pro 6.5.1	Dispositivos Moleculares	N/A
Placa de 96 poços (poliestireno preto sólido com fundo plano e não tratado)	Costar	3915
Tubos de amortecimento leve	Laboratório Watson	131-915BL ou 131-915BR