Monitorando a chegada de proteínas de superfície marcadas com GFP à rede Trans-Golgi usando nanocorpos funcionalizados

Resumo

Fonte: Buser, D. P., et al. Análise da captação endocítica e transporte retrógrado para a rede Trans-Golgi usando nanocorpos funcionalizados em células cultivadas. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um método para estudar a captação e o transporte retrógrado de nanocorpos funcionalizados para entender suas vias de tráfego intracelular. Ao introduzir sulfato radiomarcado e utilizar técnicas de isolamento e detecção, este método permite o estudo da captação endocítica e da chegada da rede trans-Golgi de proteínas de carga.

Protocolo

1. Captação de Nanocorpos Funcionalizados por Células Cultivadas (para Análise de Sulfatação)

1. Em uma coifa de cultura de células, semeie ~ 400.000 a 500.000 células HeLa expressando de forma estável uma proteína repórter marcada com GFP em placas de 35 mm ou em aglomerados de 6 poços com meio completo contendo antibióticos (meio Eagle modificado de Dulbecco, DMEM, suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 100 unidades / mL de estreptomicina, 2 mM de l-glutamina e 1,5 μg / mL de puromicina).
   nota: Como mencionado acima, usamos aqui células HeLa expressando de forma estável EGFP-Calnexin, EGFP-CDMPR e TfR-EGFP para fins de ilustração. Além de linhagens celulares estáveis, também HeLa transfectado transitoriamente pode ser usado.
2. Incubar as células O/N a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 7,5% para proliferar.
   nota: As células devem ter uma confluência de ~ 80% no dia seguinte.
3. Remova o meio completo, lave 2 vezes com 1x PBS em RT e deixe as células sem sulfato (SFM) por 1 h a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 7,5%
   nota: O SFM é preparado adicionando 10 mL de solução de aminoácidos MEM (50x), 5 mL de L-glutamina (200 mM), 5 mL de solução vitamínica (100x) e 900 μL de CaCl₂ · 2H₂O a 500 mL de sais balanceados de Eagle. Passar por um filtro de 0,22 μm e alíquota.
4. Em um exaustor ventilado ou bancada designada para trabalhos de radioatividade, prepare um meio de marcação de sulfato contendo 0.5 mCi/mL [³⁵S] de sulfato como um sal de sódio em SFM.
   cuidado: Manuseie cuidadosamente todas as soluções que contenham radioatividade. Trabalhe apenas em exaustores ou bancos designados. Todo o material (pontas, tubos, placas, etc.) ou tampões de lavagem em contato com a radioatividade devem ser coletados e descartados separadamente. Faça isso para todas as etapas abaixo (etapas 1.5-1.18) também.
5. Adicione VHH-2xTS em 1x PBS no meio de marcação de sulfato até uma concentração final de 2 μg/mL.
   nota: Como controle, inclua também VHH-std ou outro nanocorpo desprovido de sítios TS para demonstrar a marcação específica.
6. Substitua o SFM por 0,7 mL de meio de marcação de sulfato contendo 0,5 mCi/mL de sulfato [35S] e 2 μg/mL de VHH-2xTS e incube as células por 1 h a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 7,5% designada para trabalhar com radioatividade.
   nota: Dependendo do experimento planejado, o tempo de sulfatação do nanocorpo precisa ser ajustado. Além disso, para determinar a cinética de chegada do TGN, a rotulagem é realizada para diferentes momentos (por exemplo, por 10 min, 20 min, 30 min, etc.).
7. Remova o meio de rotulagem e lave as células 2-3 vezes com 1x PBS gelado em uma placa de resfriamento ou gelo.
8. Adicione 1 mL de tampão de lise (PBS contendo 1% de Triton X-100 e 0,5% de desoxicolato) suplementado com 2 mM de PMSF e 1x coquetel de inibidores de protease e incube as células por 10-15 min em uma plataforma de balanço a 4 ° C.
9. Raspe e transfira o lisado para um tubo de 1,5 mL, vortex o lisado e coloque por 10-15 min em um rotador de ponta a ponta a 4 ° C.
10. Preparar um lisado pós-nuclear por centrifugação a 10.000 x g durante 10 min a 4 °C.
11. Usando um novo tubo de 1,5 mL, prepare 20-30 μL de uma pasta de esferas de níquel em um tubo de 1,5 mL e lave uma vez com 1x PBS, peletizando-os suavemente a 1.000 x g por 1 min.
    nota: Em vez de grânulos de níquel, grânulos de estreptavidina (se o nanocorpo for biotinilado) ou grânulos de proteína A com um IgG contra um epítopo do nanocorpo (T7- ou HA-tag) podem ser usados.
12. Transferir o lisado pós-nuclear para um tubo de 1,5 ml contendo esferas de níquel e incubar durante 1 h a 4 °C num rotador de ponta a ponta para isolar os nanocorpos. Remova uma alíquota (50-100 μL) do lisado pós-nuclear e ferva em tampão de amostra SDS para análise subsequente de imunoblot de nanocorpo associado a células totais, repórter GFP e controle de carga.
13. Lave as esferas 3 vezes com 1x PBS ou tampão de lise peletizando suavemente a 1.000 x g por 1 min.
    nota: Para uma lavagem mais rigorosa dos grânulos, o imidazol 20 mM pode ser incluído no PBS ou no tampão de lise.
14. Remova cuidadosamente todo o tampão de lavagem dos grânulos, adicione 50 μL de tampão de amostra 2x e ferva por 5 min a 95 °C.
15. Carregue ambas as esferas fervidas em um gel midi 12,5% SDS-PAGE e execute de acordo com o protocolo PAGE padrão até que o corante de referência (por exemplo, azul de bromofenol) atinja o final do gel de separação.
    nota: A análise de immunoblot do nanocorpo associado a células totais, repórter GFP e controle de carga também pode ser realizada usando um mini SDS-PAGE de 12,5% ou gel de gradiente pré-moldado.
16. Fixe o gel de separação em ~ 30 mL de tampão de fixação (10% de ácido acético e 45% de metanol em ddH₂O) por 1 h em RT, lave o gel três vezes com ~ 50 mL de água deionizada e prepare para a secagem do gel.
17. Secagem de géis SDS-PAGE.​
    1. Coloque cuidadosamente o gel fixo em filme plástico esticado e cubra-o com papel de filtro pré-cortado.
    2. Coloque o gel com o papel de filtro em cima da plataforma de secagem, coloque a tampa do aspirador e ligue a bomba de vácuo para a secagem do gel. Seque o gel por 3-5 h.
    3. Remova o filme plástico e coloque o gel seco em um de autorradiografia equipado com uma tela de fósforo.
18. Autorradiografia de imagem usando um Phosphor Screen Imager. Siga as instruções do fabricante.
    nota: Dependendo da força do sinal, os géis secos precisam ser expostos por mais tempo com telas de fósforo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-GFP	Sigma-Aldrich	1.18145E+11	O produto é distribuído pela SigmaAldrich, mas fabricado pela Roche
Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	Sigma-Aldrich
Soro fetal de bezerro (FCS)	Biooeste
Enxofre-35 como sulfato de sódio	Análise Hartmann	ARS0105	O produto contém 5 mCi
Placas de 6 poços	TPP	Rolamento 92406
Paraformaldeído (PFA)	Aplicativo	Resposta 3813
Fluoromount-G	Biotecnologia do Sul	Nº 0100-01
Géis Mini-Protean TGX, 4-20%, 15 poços	Bio-Rad	456-1096