Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Cultura de parasitas
NOTA: Siga os regulamentos locais para manuseio de patógenos humanos.
- Manter os parasitas Plasmodium falciparum de acordo com o protocolo padrão descrito anteriormente no meio de cultura do parasita (ver Tabela de Materiais).
- Mantenha os parasitas firmemente sincronizados usando o tratamento com sorbitol, conforme descrito anteriormente.
- Para garantir a expressão VAR2CSA na superfície dos eritrócitos infectados por Plasmodium falciparum (IE), realize rodadas repetidas de seleção imunomagnética usando um anticorpo anti-VAR2CSA (por exemplo, anticorpo PAM1.4, uma IgG monoclonal humana VAR2CSA-específica de reação cruzada) acoplado a esferas magnéticas de proteína G.
- Em resumo, incube trofozoítos-IEs em estágio avançado com esferas magnéticas acopladas a um anticorpo anti-VAR2CSA e selecione positivamente usando um ímã.
- Expanda os parasitas selecionados em cultura por alguns ciclos até que a parasitemia seja de pelo menos 5%.
- Alternativamente, selecione parasitas que se ligam a CSA imobilizado com plástico (o receptor para VAR2CSA) conforme descrito anteriormente.
- Para verificar VAR2CSA expressão nos parasitas selecionados, realize citometria de fluxo conforme descrito anteriormente.
- Em resumo, marque os trofozoítos-IEs em estágio avançado com o mesmo anticorpo usado para a seleção magnética (etapa 1.3) seguido por um anticorpo secundário marcado com fluorescência.
- Meça a reatividade da superfície do EI por citometria de fluxo. A seleção bem-sucedida de anticorpos normalmente resulta em uma população de parasitas que expressa VAR2CSA na maioria dos parasitas (≈80%).
- Para o ensaio de fagocitose, use trofozoítos-IEs purificados em estágio intermediário a tardio. Realize a purificação usando separação magnética conforme descrito anteriormente.
nota: Para determinar com precisão o estágio dos parasitas, realize a coloração de Giemsa em esfregaços de sangue seguida de observação por microscopia de luz. Siga os procedimentos padrão e as diretrizes morfológicas descritas anteriormente. A purificação em estágio avançado também pode ser realizada usando um meio de gradiente de densidade. O rendimento do IE, no entanto, em nossa experiência é menor e, portanto, a purificação magnética é preferível.
- Para separação magnética, gire a cultura do parasita (5-10% de parasitemia) a 500 x g por 10 min em temperatura ambiente. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio de cultura do parasita.
- Adicione a suspensão parasita em uma coluna Claricep Flash Silica, CS acoplada a um ímã (consulte a Tabela de Materiais) e deixe-a passar lentamente pela coluna. Os trofozoítos-IEs são paramagnéticos (devido à presença de hemozoína) e permanecerão na malha da coluna.
- Lavar a coluna com 50 ml de meio de cultura do parasita e eluir os IE da coluna magnética utilizando 50 ml de meio de cultura do parasita.
- Girar o eluído de 1.5.3 a 500 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspendê-lo em 1 ml de meio de cultura do parasita.
- Usando um hemocitômetro, conte o número de EIs (facilmente identificados por microscopia óptica como eritrócitos com pigmento de hemozoína escuro) e o número total de células para calcular a parasitemia final (porcentagem de EIs).
nota: Use apenas parasitas com pelo menos 80% de pureza (80% de IEs).
- Com base no número de amostras de soro/anticorpos planejadas para teste, estime a quantidade total de IEs necessários e aumente as culturas de parasitas de acordo. Um frasco de culturade 75 cm 2 com 25 mL de cultura a 5% de hematócrito e 5-10% de parasitemia deve produzir IEs suficientes para executar uma placa completa de 96 poços. Para uma placa completa (42 amostras mais 6 controles em duplicata), é necessário um mínimo de 1,5 mL de suspensão parasitária a 3,3 x 107 IEs/mL.
2. Células THP-1
NOTA: A linha celular THP-1 é usada neste ensaio. Esta linhagem de células monocitárias é derivada de um paciente com leucemia monocítica e pode ser adquirida na American Type Culture Collection (ATCC). Mantenha a linhagem celular de acordo com as instruções do provedor no meio de cultura THP-1 (consulte a Tabela de Materiais).
- Para manutenção regular, inicie a cultura de células THP-1 em 2-4 x 105 células/mL e subcultive quando a concentração celular atingir 8 x 105 células/mL.
nota: Não permita que a concentração da célula exceda 1 x 106 células/mL e acompanhe o número de passagem. Evite o uso de células que estejam além da passagem 25. O tempo médio de duplicação da linha celular THP-1 varia entre 19-50 h. Determine o tempo de duplicação do lote de células antes de iniciar os experimentos de fagocitose. Isso ajudará a estimar aproximadamente a quantidade necessária de cultura necessária para um determinado número de amostras de soro a serem testadas (por exemplo, para uma placa completa de 96 poços, são necessários 10 mL de cultura a 5 x 105 células/mL).
- Verifique periodicamente as células THP-1 quanto à expressão superficial dos receptores Fcfγ I (CD64), II (CD32) e III (CD16), conforme descrito anteriormente.
- Em resumo, core as células THP-1 (separadamente) com anticorpos anti-CD64, anti-CD32 e anti-CD16 marcados com fluorescência (Tabela de Materiais) por 30 min em temperatura ambiente (diluição 1:100 preparada em soro fetal bovino (FBS) a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Lave três vezes com 2% de FBS em PBS e meça a coloração da superfície por citometria de fluxo.
nota: As células THP-1 são negativas para CD16 e positivas para CD32 e CD64, conforme relatado anteriormente (Figura 1).
- Para o ensaio de fagocitose, montar um frasco de cultura de células THP-1 com 2,5 x 105 células/mL no dia anterior ao experimento para produzir cerca de 5 x 105 células/mL no dia do ensaio.
nota: Certifique-se de que 4-6 x 105 células/mL estejam presentes no dia do ensaio.
3. Ensaio de fagocitose (Figura 2)
- Antes de iniciar o ensaio, bloquear (>1 h) duas placas de fundo redondo de 96 poços (uma para a opsonização e outra para a fagocitose) usando 150 μL por poço de FBS estéril a 2% em PBS.
nota: Rotule a placa 1 como uma placa de opsonização e use-a tanto para coloração de brometo de etídio (EtBr) quanto para opsonização. Rotule a placa 2 como uma placa de fagocitose e use tanto para o plaqueamento de células THP-1 quanto para a etapa de fagocitose.
- Coloração e opsonização de parasitas
- Tomar a suspensão de EI preparada em 1,6 e ajustar a contagem de células para 3,3 x 107 IEs/mL adicionando meio de cultura do parasita e brometo de etídio (EtBr) para atingir uma concentração final de 2,5 μg/mL (diluição de 1:40, a partir de um estoque de 0,1 mg/mL).
nota: O EtBr cora o DNA do parasita, permitindo a detecção por citometria de fluxo.
cuidado: EtBr é um mutagênico e irritante para a pele, os olhos e as vias respiratórias. Use proteção adequada e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos locais.
- Remova a solução de bloqueio de uma das placas de 96 poços (placa de opsonização), sacudindo a placa e removendo o excesso de líquido sobre um pedaço de papel toalha.
- Adicionar 30 μL por alvéolo da suspensão IE preparada acima na metade superior da placa. Deixe um poço vazio e adicione 30 μL de meio de cultura do parasita (sem IEs para o controle THP-1 sozinho). (Figura 3A). Incubar por 10 min em temperatura ambiente e protegido da luz.
- Adicionar 170 μL por alvéolo de meio de cultura do parasita. Girar a placa a 500 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante sacudindo a placa sobre um recipiente de resíduos adequado.
- Lave os IEs marcados com EtBr mais duas vezes usando 200 μL por poço de meio de cultura do parasita, girando a placa a 500 x g por 3 min em temperatura ambiente. O sobrenadante da primeira lavagem pode ser removido sacudindo a placa. Remova cuidadosamente o sobrenadante da segunda lavagem usando uma pipeta multicanal para certificar-se de que todo o volume do meio de lavagem seja removido. Não perturbe o pellet.
- Ressuspenda os IEs marcados com EtBr em 30 μL de solução de anticorpo/plasma/soro preparada nas concentrações desejadas em um meio de cultura de parasitas.
- Inclua sempre os seguintes controlos (Figura 3B): um controlo sem controlo de células IEs/THP-1 (meio de cultura do parasita); um controlo sem qualquer anticorpo ou plasma/soro (controlo não opsonizado); um controlo positivo utilizando o anticorpo anti-eritrócitos humanos de coelho disponível comercialmente na diluição de 1:100 (ver Tabela de Materiais); dois controles de plasma/soro negativos na diluição de 1:5 (um pool de virgens de malária e um pool de homens expostos à malária); e um controle sérico positivo na diluição de 1:5 (um pool de mulheres expostas à malária, que já estiveram grávidas (preferencialmente multigravidae)).
nota: Uma diluição de 1:100 para o controle positivo parece funcionar de forma consistente em diferentes lotes de anticorpos adquiridos (dados não mostrados). No entanto, recomenda-se descartar variações entre lotes testando várias diluições sempre que um novo lote de anticorpos é usado.
- Incubar durante 45 min no escuro a 37 °C.
- Preparação de células THP-1 e fagocitose
- Enquanto os IEs estão sendo opsonizados (3.2.8), comece a preparar as células THP-1.
- Remover as células THP-1 do balão de cultura, centrifugá-las para baixo (500 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente), decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento no meio de cultura de células THP-1.
- Gire novamente (500 x g por 5 min à temperatura ambiente), decanta o sobrenadante e ressuspende o pellet celular em 1 mL de meio de cultura de células THP-1.
- Determine a contagem de células na solução preparada acima e adicione mais meio para obter uma concentração final de 5 x 105 células / mL.
- Remova a solução de bloqueio da placa de 96 poços restante (placa de fagocitose) sacudindo a placa e removendo o excesso de líquido sobre um pedaço de papel toalha.
- Adicionar 100 μL por alvéolo da suspensão de células THP-1 preparada em 3.3.4 e colocá-la de volta na incubadora de cultura de células (Figura 3C).
- Uma vez terminado o tempo de incubação do anticorpo/plasma/soro, adicionar 170 μL por alvéolo de meio de cultura do parasita. Girar a placa a 500 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente e remover o sobrenadante sacudindo a placa sobre um recipiente de resíduos adequado.
- Lave os IEs opsonizados mais duas vezes usando 200 μL por poço de meio de cultura de parasitas, girando a placa a 500 x g por 3 min em temperatura ambiente. O sobrenadante da primeira lavagem pode ser removido sacudindo a placa. Remova cuidadosamente o sobrenadante da segunda lavagem, usando uma pipeta multicanal para certificar-se de que todo o volume do meio de lavagem seja removido. Não perturbe o pellet.
- Finalmente, ressuspenda os IEs opsonizados em 100 μL de meio de cultura de células THP-1 pré-aquecido. Transfira 50 μL de suspensão de IE opsonizada para cada poço na placa de fagocitose. Como há um total de 100 μL de IEs, cada diluição de anticorpo/soro pode ser executada em duplicatas na placa de fagocitose (Figura 3D)
nota: A quantidade de IEs e células THP-1 usadas no ensaio corresponde a uma proporção de 10:1.
- Incubar por 40 min no escuro a 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2).
nota: Não permita que a fagocitose prossiga por mais de 40 min.
- Parar a fagocitose por centrifugação a 4 °C (500 x g, 5 min) e rejeitar o sobrenadante agitando a placa. Adicione 150 μL de solução de lise de cloreto de amônio em temperatura ambiente (Tabela de Materiais) e misture por pipetagem, incube por exatamente 3 min.
nota: Esta etapa lisará os eritrócitos que não foram fagocitados pelas células THP-1.
- Pare a lise adicionando 100 μL de FBS a 2% gelado em PBS. Girar a placa a 4 °C (500 x g durante 3 min) e remover o sobrenadante sacudindo a placa sobre um recipiente de resíduos adequado.
- Lave três vezes usando 200 μL por poço de FBS a 2% gelado em PBS girando a placa a 4 ° C (500 x g por 3 min). Após a lavagem final, ressuspenda em 200 μL de FBS a 2% gelado em PBS e imediatamente, analise por citometria de fluxo.
nota: Publicações anteriores utilizaram fixação celular em paraformaldeído a 2% antes da citometria de fluxo31, mas os resultados aqui apresentados foram adquiridos imediatamente após a conclusão do ensaio. Não é recomendado adiar a aquisição de dados de citometria de fluxo armazenando a placa a 4 ° C, uma vez que a porcentagem de células EtBr + THP-1 decai rapidamente (Figura 4).
4. Aquisição e análise por citometria de fluxo
NOTA: Qualquer citômetro de fluxo que suporte o formato de placa de 96 poços e tenha os lasers/filtros apropriados para medir a fluorescência EtBr pode ser usado.
- Para aquisição, gate em células THP-1 usando um gráfico linear de dispersão direta (FSC) vs. dispersão lateral linear (SSC) usando os poços onde nenhum IE foi adicionado (Figura 2A) e adquira 10.000 eventos nesta porta.
- Meça a intensidade de fluorescência para EtBr (FL3-Log) na porta THP-1 usando um gráfico de histograma.
- Para gating, primeira porta em células THP-1 em um gráfico de densidade FSC vs. SSC, usando os poços onde nenhum IE foi adicionado (Figura 5A). Em seguida, configure uma porta positiva em um histograma FL3 (EtBr), usando as células THP-1 (sem IEs adicionados) e o controle não opsonizado (Figura 5B).
- Copie essas portas em todas as outras amostras testadas na mesma placa e determine a porcentagem de células THP-1 positivas para EtBr (células THP-1 que fagocitaram pelo menos um IE). Para cada uma das amostras testadas, a fagocitose pode ser relatada como os valores absolutos (porcentagem de células EtBr+ THP-1) ou como fagocitose relativa calculada como a porcentagem usando o controle positivo como máximo.
