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Artigo de método

Um ensaio in vitro para medir a atividade da serina protease de neutrófilos usando um repórter fluorescente

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8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

Fonte: Frey, D. L., et al. Monitoramento da atividade da elastase de neutrófilos e catepsina G em amostras de escarro humano. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para quantificar a atividade da serina protease de neutrófilos em amostras de escarro. A amostra contendo protease secretada é incubada com um repórter fluorescente com um motivo de reconhecimento. A clivagem do motivo pela protease permite a emissão de fluorescência individual pelo fluoróforo doador e aceitador do repórter, indicando a atividade da protease na amostra.

Protocolo

NOTA: Os protocolos a seguir descrevem a preparação da amostra e a quantificação da atividade das serina proteases de neutrófilos (NSPs). Os procedimentos experimentais aqui apresentados concentram-se na medição da atividade do escarro humano e da elastase de neutrófilos (NE) ou catepsina G (CG). No entanto, pequenas adaptações no protocolo de preparo de amostras possibilitam a análise de células derivadas do sangue e homogeneizados tumorais. Além disso, as atividades da metaloproteinase da matriz e da catepsina S podem ser investigadas de forma semelhante por meio de sondas FRET dedicadas

1. Preparação da amostra: is....

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Filtro de células de nylon de 100 μmCorning Inc.431752
2300 EnSpire (leitor de placas multietiquetas)PerkinElmer
Prato 35x10mm, Nunclon DeltaThermo Fisher Científico150318
Filtro de células de nylon de 40 μmCorning Inc.Rolamento 431750
Tubos de 50 mLSarstedt10535253
equilíbrioOHAUS Instruments (Xangai) Co., Ltd.PR124
Tubos de fundo redondo BD Falcon 5 mLBD Biociência352054
BD LSRFortessa analisador de célulasBD Biociência
placa de meia área de fundo plano preto 96 poçosCorning Ciências da Vida3694
Catepsina GEmpresa de produtos de elastinaSG623
Inibidor de catepsina G IMerck KGaA219372
Centrífuga 5418REppendorf AGEP5401000137
Combitips avançado 1,0 mLEppendorf AGTelefone: 0030 089 430
Inibidor completo de proteinaseRoche11697498001
Elastase leucocitária de escarro humanoEmpresa de produtos de elastinaSE563
Multipette plusEppendorf AG
NEmo-1SiChemSC-02001 mM
NEmo-2ESiChemSC-02012 mM
Pari Boy SX com um nebulizador a jato LC SprintPari085G3001
Solução salina tamponada com fosfatoGibco10010-015
ROTI Histokitt (meio de montagem)Carl Roth GmbH + Co.KGNº 6638.1
SalbutamolTeva GmbH
SivelestatProdutos químicos CaymanRolamento 17779
EsputolisinaCalbioquímica560000-1SET
sSAMem casa2 mM

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