NOTA: Os protocolos a seguir descrevem a preparação da amostra e a quantificação da atividade das serina proteases de neutrófilos (NSPs). Os procedimentos experimentais aqui apresentados concentram-se na medição da atividade do escarro humano e da elastase de neutrófilos (NE) ou catepsina G (CG). No entanto, pequenas adaptações no protocolo de preparo de amostras possibilitam a análise de células derivadas do sangue e homogeneizados tumorais. Além disso, as atividades da metaloproteinase da matriz e da catepsina S podem ser investigadas de forma semelhante por meio de sondas FRET dedicadas
1. Preparação da amostra: isolamento celular e separação do sobrenadante
NOTA: Se possível, o tratamento do escarro deve ser realizado dentro de 120 minutos após a expectoração e o escarro deve ser armazenado em gelo até o processamento posterior.
- Se a expectoração espontânea do escarro não for possível, induza o escarro conforme descrito anteriormente. Resumidamente, inale 200 μg do antagonista do receptor β-2 salbutamol antes de iniciar o procedimento de indução do escarro. Em seguida, inale uma solução salina hipertônica (6%) por 15 minutos usando um nebulizador. Colete o expectoração expectorada em uma placa de Petri.
- Separe os aglomerados de muco da saliva em uma placa de Petri com a ajuda de uma ponta de pipeta.
- Pese o muco.
nota: O peso médio de uma amostra de muco é de 0,8 g (variando entre 0,1 g e 5 g); 0,1 g geralmente é suficiente para realizar os procedimentos mencionados.
- Adicione 4 partes (v/m) de 10% de esputolisina (em PBS) ao escarro (por exemplo, 4 mL de 10% de esputolisina para cada grama de escarro).
cuidado: A esputolisina é composta de ditiotreitol concentrado em tampão fosfato, portanto, manuseie-o com cuidado.
- Incube a mistura à temperatura ambiente (RT) num agitador de balanço durante 15 min para dissolver o muco. Por razões de segurança, coloque o agitador em uma hotte.
- Sacie a reação adicionando o mesmo volume de PBS frio (por exemplo: 1 mL de PBS frio para cada mL de 10% de esputolisina).
- Misturar pipetando para obter uma solução homogénea.
- Filtrar a mistura através de um filtro de células de nylon de 100 μm para um tubo de 50 ml.
- Repita a etapa de filtração através de um filtro de células de nylon de 40 μm.
- Centrifugar a solução durante 10 min a 300 x g a 4 °C.
- Transferir cuidadosamente a fracção sobrenadante para um tubo novo e guardá-la sobre gelo.
nota: As fracções sobrenadantes podem ser armazenadas a -20 °C ou -80 °C até uma análise posterior.
- Ressuspenda suavemente o pellet celular em 500 μL de PBS frio e coloque-o no gelo.
nota: A fração celular deve ser processada imediatamente.
2. Medição da atividade da serina protease de neutrófilos
NOTA: Aqui, diferentes métodos são introduzidos para quantificar a atividade do NSP por meio de repórteres FRET. A escolha da tecnologia é ditada pela questão biomédica específica e pelo objetivo do experimento. As sondas apresentadas foram extensivamente testadas quanto à sua especificidade contra um conjunto de enzimas relevantes para o pulmão. Embora as sondas sejam específicas para sua enzima alvo, sempre verifique a especificidade da sonda na amostra clínica de interesse. Isso pode ser alcançado incubando a amostra com um inibidor de protease específico antes da adição da sonda, o que deve abolir qualquer aumento na relação doador/aceitador (D/A).
- Quantificação da atividade de NSP solúvel via fluorímetro ou ensaio leitor de placas
nota: A atividade da protease em frações solúveis da amostra pode ser detectada com qualquer instrumento capaz de detecção de fluorescência.
- Descongele as enzimas no gelo.
- Até o uso, mantenha NE e CG em um tampão de armazenamento ácido (50 mM de acetato de sódio, 200 mM de NaCl, pH 5,5) para evitar a autoclivagem.
- Para estabelecer uma curva padrão da enzima, prepare uma diluição serial de 1:2 da enzima (33,9 - 0,271 nM para NE; 42,6 - 0,333 nM para CG) em tampão de ativação (10 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl em pH 7,5). O tampão de ativação tem um pH neutro e, portanto, permite que a catálise enzimática ocorra de forma eficiente.
- Para preparar a concentração padrão mais alta (concentração NE: 33,9 nM), dilua 1 μL de NE (33,9 μM) em 999 μL de tampão de ativação.
- Para preparar o segundo padrão (concentração NE: 16,95 nM), misture 200 μL da primeira diluição com 200 μL de tampão de ativação.
- Proceda de acordo para preparar as diluições 1:2 restantes.
- O último padrão, que é o blank, é composto por um buffer de ativação puro. Recomenda-se a medição de duplicatas ou triplicatas técnicas. Durante a preparação padrão e da amostra, tente manter os frascos no gelo.
- Paralelamente à preparação padrão, diluir as amostras de escarro em um tampão de ativação. Diluir as amostras humanas antes de avaliar sua atividade de protease para permanecer na faixa linear de aumento do sinal repórter (relação D/A). Se as amostras dos pacientes não fossem diluídas, a clivagem aconteceria muito rapidamente para um ajuste confiável. Como o escarro de doador saudável contém menos proteases ativas em comparação com amostras de pacientes com fibrose cística (FC) e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), geralmente são realizadas diferentes diluições (1:10 para sobrenadante de escarro saudável, 1:20-500 para sobrenadante de escarro de pacientes com DPOC ou FC).
nota: Para medir quantitativamente a atividade da protease em amostras onde sua concentração é desconhecida, uma curva padrão com concentrações enzimáticas conhecidas precisa ser medida em paralelo, idealmente na mesma placa. A concentração da enzima ativa no escarro humano é calculada através da interpolação das inclinações medidas nas amostras de escarro humano com as medidas com as curvas padrão.
- Antes de preparar as amostras para medição, configure o instrumento. Defina o comprimento de onda de excitação para a sonda NE Förster baseada em transferência de energia de ressonância (FRET) (NEmo-1) para 354 nm e defina o comprimento de onda de detecção para 400 nm para o doador e 490 nm para o receptor. Defina o comprimento de onda de excitação para a sonda CG FRET (sSAM) para 405 nm e defina a emissão para 485 (doador) e 580 nm (aceptor).
- Adicione 40 μL de amostras, padrão ou em branco, nos poços de uma placa preta de meia área de 96 poços.
- Para preparar a mistura principal contendo os repórteres (concentração do repórter na mistura principal: 10 μM), dilua o estoque da sonda (1 mM em dimetilsulfóxido, DMSO) 1:100 em tampão de ativação. Prepare o volume de mistura principal necessário multiplicando 10 μL x o número de poços de placa necessários. Para atingir a concentração final ideal (2 μM) para medição de fluorescência de repórteres NEmo-1 e sSAM, adicione 10 μL da mistura principal a cada poço (contendo 40 μL de qualquer amostra, padrão ou branco) e inicie a leitura. Os repórteres NEmo-1 e sSAM monitorarão, portanto, a atividade da elastase solúvel de neutrófilos e da catepsina G, respectivamente.
nota: Se um injetor de reagente não estiver disponível, certifique-se de iniciar a leitura o mais rápido possível após a adição do relator às amostras.
- Inicie a medição do leitor de placas e registre o aumento da relação D/A a cada 60-90 segundos por pelo menos 20 minutos ou até que o aumento do sinal atinja um platô.
- Depois que os dados forem exportados, calcule a relação D/A dividindo as unidades de fluorescência relativa do doador (RFU) com o RFU aceitador para cada ponto de tempo e amostra.
- Calcule a média da relação D/D e o desvio padrão de cada amostra.
- Determine a inclinação dentro do crescimento linear da mudança da razão D/A. A inclinação é um indicador da taxa de clivagem enzimática para uma sonda FRET. Calcular a concentração da enzima activa no expetoração ajustando as inclinações de regressão linear derivadas das amostras humanas com as calculadas a partir do padrão enzimático.
