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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Preparação de dispositivos microfluídicos.
- Preparação do ensaio de migração celular microfluídica
- Prepare 50 μg / mL de solução de fibronectina diluindo 50 μL de solução de estoque de fibronectina (1 mg / mL) para 950 μL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) dentro de um gabinete de biossegurança.
- Prepare o meio de migração misturando 9 mL de meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e 1 mL de RPMI-1640 com albumina de soro bovino a 4% (BSA).
- Remova a água deionizada do dispositivo.
- Adicione 100 μL de solução de fibronectina ao dispositivo a partir da saída. Aguarde 3 minutos para garantir que todos os canais estejam preenchidos com solução de fibronectina. Coloque o dispositivo microfluídico em uma placa de Petri coberta por 1 h em temperatura ambiente.
- Remova a solução de fibronectina do dispositivo. Adicione 100 μL de meio de migração da tomada. Aguarde 3 minutos para garantir que todos os canais sejam preenchidos com o meio de migração.
- Incubar o dispositivo por mais 1 h à temperatura ambiente; o dispositivo está então pronto para o experimento de quimiotaxia.
- Preparação da solução quimioatraente para o experimento de quimiotaxia.
- Prepare a solução de fMLP de 100 nM em um total de 1 mL de meio de migração. Misture 5 μL de estoque FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) com a solução fMLP em um tubo de 1,5 mL.
nota: O FITC-Dextran é usado para medição de gradiente. Como alternativa, use a rodamina como indicador de gradiente. A solução quimioatraente fMLP está então pronta para o experimento de quimiotaxia.
- Preparo de amostra de escarro.
nota: A quimiotaxia de neutrófilos induzida por um gradiente de amostras de escarro de pacientes com DPOC foi testada como uma aplicação diagnóstica clínica deste método all-on-chip.
- Obter um protocolo de ética humana para coleta de amostras de escarro de pacientes com DPOC.
nota: Obtivemos aprovações para coletar amostras no Hospital Geral Seven Oaks em Winnipeg (aprovado pela Universidade de Manitoba).
- Obtenha os formulários de consentimento informado por escrito de todos os sujeitos.
- Colete amostras de escarro espontâneo de pacientes com DPOC. Coloque 500 μL de amostra de escarro em um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 500 μL de ditiotreitol a 0,1% no tubo de 1,5 mL e misture suavemente. Coloque o tubo em banho-maria a 37 °C por 15 min.
- Centrifugar a amostra a 753 x g durante 10 min e recolher o sobrenadante. Centrifugar o sobrenadante a 865 x g durante 5 min e recolher o sobrenadante final. Conservar o sobrenadante recolhido num congelador a -80 °C antes da utilização.
- Quando estiver pronto para o experimento de quimiotaxia, descongele a solução de escarro; transfira 900 μL de meio de migração para um tubo de 1,5 mL e misture com 100 μL de solução de escarro dentro de um gabinete de biossegurança; a solução de escarro está então pronta para o experimento de quimiotaxia.
- Coleta de amostra de sangue.
- Obter um protocolo de ética humana para coletar amostras de sangue de doadores saudáveis. Obter o termo de consentimento livre e esclarecido de todos os doadores de sangue.
nota: Aqui, as amostras foram obtidas no Victoria General Hospital em Winnipeg (aprovado pelo Conselho de Ética em Pesquisa do Corpo Docente Conjunto da Universidade de Manitoba).
- Colete a amostra de sangue por punção venosa e coloque a amostra em um tubo revestido com EDTA. Mantenha o tubo em um gabinete de biossegurança antes do experimento.
2. Operação de ensaio de quimiotaxia all-on-chip
- Isolamento de células no chip (Figura 1B).
- Colocar 10 μL de sangue total em um tubo de 1,5 mL dentro de um gabinete de biossegurança.
nota: Os detalhes da coleta de amostras de sangue estão na seção 1.4.
- Adicione 2 μL de coquetel de anticorpos (Ab) e 2 μL de partículas magnéticas (MP) do kit de isolamento de neutrófilos (consulte a tabela de materiais) no tubo de 1,5 mL e misture suavemente; isso rotulará as células no sangue, exceto os neutrófilos.
- Incubar a mistura sangue-Ab-MP por 5 minutos em temperatura ambiente.
nota: Isso marcará magneticamente as células marcadas com anticorpos no sangue.
- Conecte dois pequenos discos magnéticos aos dois lados da porta de carregamento da célula do dispositivo. Aspire o meio de todas as portas do dispositivo.
- Pipete lentamente a mistura de 2 μL de sangue-Ab-MP no dispositivo microfluídico a partir da porta de carregamento da célula.
NOTA: As células marcadas magneticamente ficam presas nas paredes laterais da porta de carregamento da célula, enquanto os neutrófilos fluem para o dispositivo e ficam presos na estrutura de encaixe da célula.
- Aguarde alguns minutos até que neutrófilos suficientes fiquem presos na área de encaixe celular.
3. Ensaio de quimiotaxia (Figura 1C).
- Coloque o dispositivo microfluídico no microscópio com temperatura controlada stage a 37 °C.
- Adicione 100 μL de solução quimioatraente (fMLP ou solução de escarro) e 100 μL de meio de migração aos seus reservatórios de entrada designados usando dois pipetadores; isso gerará um gradiente quimioatraente no canal de gradiente por mistura química contínua baseada em fluxo laminar assistida por uma estrutura de equilíbrio de pressão.
nota: Os detalhes da coleta de escarro de pacientes com DPOC estão na seção 1.3.
- Para o experimento de controle médio, adicione apenas meio de migração a ambos os reservatórios de entrada.
- Adquira a imagem de fluorescência do FITC-Dextran no canal gradiente.
- Importe a imagem para o software ImageJ usando o comando "File|Aberto".
- Meça o perfil de intensidade de fluorescência no canal de gradiente usando o comando "Analisar|Perfil do enredo".
- Exporte os dados de medição para uma planilha para plotagem adicional.
- Incube o dispositivo no microscópio com temperatura controlada ou em uma incubadora de cultura de células convencional por 15 min.
- Crie imagens do canal de gradiente usando uma objetiva de 10X para registrar as posições finais das células para análise de dados.
- Se necessário, registre a migração celular no dispositivo por microscopia de lapso de tempo.
4. Análise de dados de migração celular (Figura 1C)
- Analise o ensaio de quimiotaxia calculando a distância de migração celular da estrutura de encaixe, conforme descrito abaixo. Veja a Figura 1C.
- Importe a imagem para o software NIH ImageJ (ver. 1.45).
- Selecione o centro de cada célula que se moveu para o canal de gradiente.
- Meça as coordenadas das células selecionadas para suas posições finais. Meça a coordenada de um ponto na borda da estrutura de encaixe como a posição de referência inicial.
- Exporte os dados de coordenadas medidas para um software de planilha (por exemplo, Excel). Calcule a distância de migração das células como a diferença entre a posição final de uma célula e a posição de referência inicial ao longo da direção do gradiente.
- Calibre a distância para um micrômetro. Calcule a média e o desvio da distância de migração de todas as células como uma medida de quimiotaxia.
- Compare a distância de migração na presença de um gradiente quimioatraente com o experimento de controle médio usando o teste t de Student.
- Se as imagens de lapso de tempo da migração celular forem registradas, a migração celular e a quimiotaxia podem ser analisadas posteriormente pela análise de rastreamento celular.
nota: Os materiais necessários para construir e realizar o ensaio de quimiotaxia all-on-chip são detalhados na tabela de materiais.
