1. Preparação de células-alvo que expressam proteína fluorescente vermelha em seus núcleos
- Obtenha uma linhagem celular de câncer de camundongo alvo de uma fonte apropriada.
nota: Neste protocolo, um derivado altamente metastático de células tumorais mamárias de camundongo E0771 (E0771-LG) é usado. As células parentais E0771 são originárias de camundongos C57BL/6.
- Descongele e mantenha um frasco de células E0771-LG com o meio de Eagles modificado (DMEM) de Dulbecco, incluindo 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS) em uma incubadora de cultura de células a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2,
nota: Deve ser confirmado que as células são negativas para micoplasma. Para o efeito, cultivar células E0771 (ou células a testar) durante 2-3 dias, conforme descrito acima (na ausência de antibióticos e antimicóticos), e recolher 500 μL de meio de cultura. Centrifugue o meio a 12.419 x g por 60 s para eliminar os detritos celulares e transferir o sobrenadante para novos tubos. Determine a contaminação por micoplasma usando um kit de teste de micoplasma disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) e/ou PCR seguindo as instruções do fabricante.
- Semeie 5 x 103 células E0771-LG por poço em uma placa de 12 poços e cultive as células com 10% (v/v) de FBS-DMEM durante a noite em uma incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
nota: Se a taxa de proliferação das células-alvo for baixa (tempo de duplicação da população superior a 36 h), o número de células pode ser aumentado para 1 x 104.
- Substitua o meio por 1 mL de 10% (v / v) FBS-DMEM incluindo 10 μg / mL de polibreno e adicione 25 μL de partículas lentivirais (1 x 106 TU / mL) que codificam uma proteína fluorescente vermelha restrita nuclear (mKate2, consulte a Tabela de Materiais).
- Cultivar as células durante 24 h numa incubadora a 37 °C, 95% de humidade e 5% de CO2.
- Substitua o meio por 10% (v / v) de FBS-DMEM e cultive as células por 24-48 h em uma incubadora a 37 ° C, 95% de umidade e 5% de CO2.
- Substitua o meio por 10% (v/v) de FBS-DMEM, incluindo 1 μg/mL de puromicina, quando as células começarem a expressar uma proteína fluorescente vermelha, e cultive as células até que estejam 80-90% confluentes.
nota: A concentração de puromicina será diferente entre os tipos de células-alvo e deve ser otimizada usando células não transfectadas.
- Subcultive as células sobreviventes por 1-3 passagens com 10% (v / v) de FBS-DMEM, incluindo 1 μg / mL de puromicina, e estoques de criopreservação em um sistema de armazenamento de fase de vapor de nitrogênio líquido até o uso.
2. Isolamento de células supressoras dos tumores em camundongos
NOTA: Neste protocolo, células supressoras (ou seja, macrófagos associados a metástases (MAMs) e células supressoras derivadas de mielóides monocíticos (M-MDSCs)) são isoladas do pulmão contendo tumores metastáticos estabelecidos por células E0771-LG. As condições para dissociação de tecidos e classificação de células devem ser otimizadas para isolar as células de diferentes tecidos.
- Injete 1 x 106 células cancerígenas (E0771-LG) na veia da cauda de camundongos singênicos (C57BL / 6), fêmeas, de 7 a 10 semanas de idade.
- Após 14 dias, isolar o pulmão contendo tumores metastáticos e preparar suspensões unicelulares dos pulmões perfundidos por meio de digestão enzimática, conforme descrito anteriormente.
nota: Neste protocolo, quatro camundongos são injetados com células cancerígenas e seus pulmões metastáticos são combinados para obter células supressoras suficientes.
- Incube as suspensões de célula única com anticorpo anti-camundongo CD16 / CD32 por 30 min no gelo e coradas com anticorpos fluorescentes para CD45, F4 / 80, CD11b, Ly6C e Ly6G (consulte a Tabela de Materiais) por mais 30 min.
- Lave as células coradas uma vez com 1 mL de PBS contendo 2% (p / v) de albumina de soro bovino (BSA) e ressuspenda o pellet celular com 500-1000 μL de PBS contendo 2% (p / v) de BSA.
- Adicione 3 μM de DAPI e classifique M-MDSCs (DAPI – CD45 + F4 / 80 + Ly6G - CD11balto, Ly6Calto) e MAMs (DAPI - CD45 + F4 / 80 + Ly6G-CD11b alto, Ly6Cbaixo) usando um classificador de células (Figura 1).
nota: O limite do nível de Ly6C para distinguir MAMs (Ly6Clow) e M-MDSCs (Ly6Chigh) é baseado no dos macrófagos alveolares residentes (RMAC). A pureza das células selecionadas é medida por citometria de fluxo com uma pureza esperada de mais de 90%.
- Ressuspenda as células classificadas com 400 μL de DMEM contendo 20% (v / v) de FBS, 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 1% (v / v) de aminoácido não essencial, 1 mM de piruvato de sódio e 50 nM de 2-mercaptoetanol (chamado DMEM, E-DMEM).
- Conte o número de células vivas usando o método de exclusão azul de Trypan e ajuste para 2 x 106 células/mL com E-DMEM.
- Mantenha as células no gelo até o uso.
3. Isolamento de células T CD8+ do baço de camundongos
- Isole o baço de um camundongo que seja singênico à linhagem de células cancerígenas alvo (ou seja, camundongos C57BL / 6 neste protocolo) da seguinte forma:
- Eutanásia do animal por inalação de CO2.
- Coloque o animal em uma tábua de dissecação limpa e limpe a pele com etanol a 70% (v/v).
- Corte a pele abdominal usando uma tesoura para expor o baço
- Isole o baço, que está localizado abaixo do estômago, e coloque-o em um tubo contendo 5 mL de PBS gelado.
- Usando o êmbolo interno de uma seringa estéril de 5 mL, triture o baço em um filtro de células de 100 μm colocado em um tubo de 50 mL.
- Passe as células pelo filtro usando um total de 10 mL de PBS.
- Centrifugue a suspensão celular a 337 x g por 5 min e aspire o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de PBS contendo 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 0,5% (p / v) de BSA (tampão de corrida) e filtre através de um filtro de célula de 40 μm.
- Conte o número de células ativas e ajuste para 1 x 108 células/mL usando o buffer de execução.
nota: Conservar uma pequena alíquota de células como amostra de pré-enriquecimento para um controlo da pureza.
- Enriqueça para células T CD8+ usando um kit de seleção negativa e um classificador magnético (consulte a Tabela de Materiais).
- Transfira 1 x 108 (1 mL) das células dos esplenócitos para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL.
- Adicione 50 μL de anticorpos biotinilados e incube em temperatura ambiente por 10 min.
- Adicione 125 μL de esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina e incube em temperatura ambiente por 5 min.
- Adicione 1.325 mL de tampão corrido e misture delicadamente pipetando.
- Coloque o tubo no ímã e incube em temperatura ambiente por 2,5 min.
- Pegue o ímã e despeje a suspensão de célula enriquecida em um novo tubo.
- Ressuspenda as células enriquecidas com 200 μL de E-DMEM (ou seja, DMEM contendo 20% (v / v) de FBS, 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 1% (v / v) de aminoácido não essencial, 1 mM de piruvato de sódio e 50 nM de 2-mercaptoetanol).
- Conte o número de células vivas e ajuste para 2 x 106 células/mL com E-DMEM. Manter as células a 37 °C em incubadora de CO2 até o uso.
nota: Manter uma pequena alíquota de células como amostra pós-enriquecimento para um controlo da pureza.
- Determinar a pureza das células T CD8+ por citometria de fluxo do seguinte modo:
- Pegue 1 x 104 células de amostras de pré-enriquecimento (etapa 3.6) ou pós-enriquecimento (etapa 3.9) e ajuste o volume total de cada uma para 100 μL usando um buffer de execução.
- Incube as suspensões de célula única com anticorpo anti-camundongo CD16 / CD32 por 30 min no gelo e cove com anticorpos fluorescentes para CD45, CD3, CD4 e CD8 (consulte a Tabela de Materiais) por mais 30 min.
- Lave as células coradas com 500 μL de PBS contendo 2% (p / v) de BSA e ressuspenda o pellet celular com 500-1000 μL de PBS contendo 2% (p / v) de BSA.
- Adicione 3 μM de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e determine a porcentagem de células CD3+CD4–CD8+ na população total de células CD45+.
4. Ativação e expansão das células T CD8+ isoladas
- Alíquota 1 x 105 células por 50 μL de células T CD8+ (preparadas na etapa 3.9) em alvéolos de uma placa de 96 poços com fundo em U.
- Adicione 1 x 105 células por 50 μL de células supressoras (preparadas na etapa 2.7) ou 50 μL de E-DMEM nos poços.
- Prepare o meio de ativação que consiste em E-DMEM, 4 x 104 U/mL fator estimulador de colônia 1 (CSF-1), 240 U/mL de interleucina-2 (IL-2), 8 μg/mL anticorpo CD3ε de camundongo e 16 μg/mL anticorpo anti-CD28 de camundongo.
nota: O CSF-1 não é necessário para a ativação das células T, mas é essencial para a sobrevivência das células supressoras neste protocolo (ou seja, MAMs e M-MDSCs). Assim, é retido na co-cultura de células T com células-alvo cancerígenas para manter a consistência nas condições de cultura. Como o CSF-1 é encontrado em concentrações nanomolares em todos os tecidos e é necessário para a viabilidade de monócitos / macrófagos in vivo, este é um contexto fisiológico para essas células.
- Adicione 50 μL de meio de ativação (etapa 4.3) e 50 μL de E-DMEM com ou sem reagentes a serem testados.
- Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2 e cultive as células por 4 dias.
5. Configuração da co-cultura de células-alvo com células T CD8+ pré-ativadas
- Adicione 30 μL de matriz de membrana basal solúvel reduzida por fator de crescimento diluído 1:100 (Tabela de Materiais) nos poços de placa de fundo plano de 96 poços adequada para microscopia e incube a 37 ° C em uma incubadora de CO2 por pelo menos 1 h.
- Prepare as células-alvo (ou seja, células E0771-LG que expressam proteína fluorescente vermelha com restrição nuclear).
- Incube as células-alvo com 1 mL de tripsina / EDTA a 0,05% em temperatura ambiente por 1 min e colha as células por pipetagem suave.
- Adicione 9 mL de DMEM, incluindo 10% (v / v) de FBS, e centrifugue a suspensão celular a 337 x g por 5 min.
- Ressuspenda as células com 500 μL de E-DMEM e conte o número de células vivas.
nota: Antes de contar as células-alvo, filtre as células através de um filtro de células de 40 μm para produzir uma suspensão de célula única.
- Ajuste a densidade para 2 x 104 células/mL (= 1 x 103 células por 50 μL) adicionando E-DMEM e mantenha as células congeladas.
- Prepare células efetoras (ou seja, células T CD8+ pré-ativadas).
- Ressuspenda as células em um poço de uma placa de 96 poços (etapa 4.5) completamente pipetagem e transfira as células T CD8+ flutuantes para um novo tubo de 1,5 mL.
nota: MAMs e M-MDSCs aderem firmemente ao poço e não são destacados pela pipetagem.
- Para coletar as células restantes, adicione 200 μL de PBS no poço e transfira-o para o tubo na etapa 5.3.1.
- Lave as células com 1 mL de E-DMEM uma vez (centrifugue a 337 x g) por 5 min, aspire e descarte o sobrenadante) e ressuspenda-as com 100 μL de E-DMEM.
- Conte o número de células vivas (usando o método de exclusão de azul de tripano), ajuste a densidade para 1,6 x 105 células / mL (= 4 x 103 células / 25 μL) e mantenha as células no gelo.
- Aspire a matriz da membrana basal de cada poço da placa na etapa 5.1.
- Adicione 1 x 103 células/50 μL de células-alvo (etapa 5.2.4) em cada poço e misture bem.
nota: Para evitar efeitos de borda devido à evaporação do meio, apenas os 60 poços internos da placa de 96 poços devem ser usados para análise.
- Adicione 25 μL de E-DMEM, incluindo 4 x 103 U / mL de substrato de IL-2 e 10 μM de caspase-3 fluorogênica (consulte a Tabela de Materiais).
- Adicione 4 x 103 células/25 μL de células T CD8+ (etapa 5.3.4) em poços apropriados e misture bem.
nota: A presença de muitas células em um poço torna a análise mais difícil. Neste modelo, uma proporção de 4:1 efetor:alvo (número total de células 5 x 103 células/poço) foi ótima, mas uma proporção de 8:1 foi abaixo do ideal. Os poços contendo os quatro controles a seguir são necessários para auxiliar na análise dos dados: células-alvo na densidade usada para os poços de co-cultura (1 x 103 células/poço) em meio com e sem substrato de caspase-3, células efetoras (1 x 103 células/poço) em meio com e sem substrato de caspase-3.
- Adicione 200 μL de PBS ou água estéril em todos os poços vazios (particularmente poços na periferia da placa) para reduzir a evaporação do meio dos poços experimentais.
- Coloque a placa em um microscópio de fluorescência de lapso de tempo que seja mantido a 37 °C, 95% de umidade e 5% de CO2.
nota: Agite a placa em um padrão cruzado para distribuir todas as células uniformemente e, em seguida, deixe a placa permanecer em temperatura ambiente em uma superfície plana por 10-20 minutos antes de transferir para a incubadora.
6. Imagem das células
NOTA: As configurações detalhadas de aquisição de imagem variam de acordo com o microscópio e os fluoróforos usados; os seguintes parâmetros gerais de aquisição devem ser empregados para obter os melhores resultados.
- Usando uma rotina de foco automático apropriada no microscópio, adquira imagens que cubram pelo menos 25% da área de superfície total em cada poço experimental da placa de 96 poços.
- Ajuste o microscópio para adquirir imagens em contraste de fase, bem como um canal fluorescente adequado para a proteína fluorescente vermelha com restrição nuclear (mKate2) e um canal fluorescente adequado para o substrato de caspase-3 ativada fluorogênica verde (com excitação a 488 nm) (Figura 2).
- Capture imagens em poços experimentais em contraste de fase e os 2 canais fluorescentes a cada 1 a 3 h por pelo menos 72 h.
