Avaliação da ativação de múltiplas caspases em macrófagos

Resumo

Fonte: Han, J. et al., Avaliação da ativação da caspase para avaliar a morte de células imunes inatas.J. Vis. Exp.(2023)

Este vídeo demonstra a avaliação de múltiplas ativações de caspase em macrófagos derivados da medula óssea por meio da estimulação com o vírus influenza. Após a lise dos macrófagos, inativação do lisado pelo calor e centrifugação, as caspases intracelulares são coletadas para análise imunológica subsequente.

Protocolo

1. Preparando as soluções

1. Prepare a mídia condicionada em L929.
   1. A placa 1 × 10⁶ células L929 (ver Tabela de Materiais) em um frasco de cultura de tecidos de 182 cm² contendo 50 mL de meio de cultura L929 (ver Tabela 1 para a preparação do meio).
   2. Cultive as células em uma incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de dióxido de carbono, CO₂.
   3. Após 7 dias, colete o sobrenadante e filtre usando um filtro de 0,45 μm. Prepare alíquotas de 50 mL (armazene alíquotas congeladas a -80 ° C por até 1 ano).
2. Prepare 500 mL de meios de cultura de macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) (Tabela 1).
3. Prepare 500 mL de meios de estimulação BMDM (Tabela 1).
4. Prepare 500 mL de meio para infecção (Tabela 1).
5. Prepare 100 mL de tampão Tris 1 M (Tabela 1).
6. Prepare 4x tampão dodecil sulfato de sódio (SDS) (Tabela 1).
7. Prepare 1 mL de 1,4-ditiotreitol 1 M (DTT, Tabela 1).
8. Prepare 40 mL de tampão de lise de caspase (Tabela 1).
9. Prepare 100 mL de tampão Tris 1,5 M (Tabela 1).
10. Prepare 100 mL de uma solução SDS a 10% (peso / vol) (Tabela 1).
11. Prepare 50 mL de um tampão de ensaio de radioimunoprecipitação 2x (RIPA) (Tabela 1).
12. Prepare uma solução de LPS de lipopolissacarídeo 5 mg / mL (Tabela 1).
13. Prepare uma solução de trifosfato de adenosina 0,5 M, ATP (Tabela 1).
14. Prepare as soluções de western blotting.
    1. Prepare 1 L de estoque regulador 5x em funcionamento (Tabela 1).
    2. Prepare 1 L de estoque regulador de transferência 10x (Tabela 1).
    3. Prepare 1 L de solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST, Tabela 1).
    4. Prepare 100 mL de uma solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso / vol) (Tabela 1).
15. Prepare as soluções primárias de anticorpos.
    1. Prepare 10 mL de anticorpo primário caspase-1 (Tabela 1).
    2. Prepare 10 mL de anticorpo primário caspase-11 (Tabela 1).
    3. Prepare 10 mL de anticorpo primário caspase-3 (Tabela 1).
    4. Prepare 10 mL de anticorpo primário caspase-7 (Tabela 1).
    5. Prepare 10 mL de anticorpo primário caspase-8 (Tabela 1).
    6. Prepare 10 mL de anticorpo primário caspase-9 (Tabela 1).
    7. Prepare 10 mL de anticorpo primário de β-actina conjugado com HRP (Tabela 1).
16. Preparar as soluções de anticorpos secundários.
    1. Prepare 10 mL de anticorpo secundário anti-coelho (Tabela 1).
    2. Prepare 10 mL de anticorpo secundário anti-camundongo (Tabela 1).
    3. Prepare 10 mL de anticorpo secundário anti-rato (Tabela 1).

2. Isolando macrófagos derivados da medula óssea

NOTA: Para este protocolo, podem ser usados camundongos selvagens de 6 a 10 semanas com vias intactas de morte celular programada (PCD) ou camundongos mutantes com os reguladores, efetores ou moléculas de interesse de PCD excluídos ou alterados.

1. Eutanasiar um camundongo em uma câmara de CO₂ com uma taxa de fluxo que desloca 10% -30% do volume da gaiola por minuto por 2-3 min. Em seguida, execute um método de eutanásia secundária, como luxação cervical. Siga todas as diretrizes e regulamentos adicionais específicos de instalações, instituições e governos, sempre que aplicável.
2. Disseque o mouse para recuperar os ossos da perna traseira.
   1. Prenda o mouse de costas para que o abdômen fique exposto. Pulverizar com etanol a 70% (vol/vol) para esterilizar as patas traseiras e o abdômen.
      cuidado: O etanol é inflamável. Mantenha-o longe de chamas abertas.
   2. Use uma tesoura para fazer uma incisão na linha média do abdômen; continue cortando em direção às pernas para tornar os fêmures visíveis.
   3. Pegue a perna traseira direita e puxe a pele para longe do corpo em direção à linha média. Separe a perna do corpo cortando os músculos adutores em direção à linha média; Em seguida, corte a perna entre a articulação do quadril e a coluna. Em seguida, corte a pata distal ao tornozelo e remova o excesso de tecido do osso descascando a pele e usando uma tesoura levemente aberta para retirar o tecido da panturrilha.
   4. Coloque a perna em uma toalha embebida em etanol a 70% (vol/vol) e disseque a tíbia e o fêmur.
      1. Prenda a tíbia e o fêmur, cada um com um conjunto separado de pinças. Pressione suavemente a tíbia contra a direção natural da articulação do joelho; Isso fará com que a tíbia se quebre no joelho.
      2. Use a pinça e a tesoura de dissecação, se necessário, para remover qualquer tecido pendurado restante. Guarde a tíbia para uso posterior, colocando-a sobre a toalha embebida em etanol.
      3. Colete o fêmur da mesma maneira, quebrando o joelho.
   5. Repita as etapas 3 e 4 acima para a perna esquerda para removê-la do corpo e dissecar a tíbia e o fêmur.
   6. Pulverize os ossos com etanol a 70% (vol / vol).
   7. Limpe os ossos colocando-os em uma toalha limpa embebida em etanol a 70% (vol / vol), apertando a parte carnuda da toalha e esfregando a toalha contra o osso para remover o excesso de tecido.
3. Quando os fêmures e as tíbias estiverem limpos, borrife os quatro ossos com etanol a 70% (vol/vol). Colete os ossos em uma placa de Petri estéril e lave-os com 10 mL de meio de cultura BMDM, agitando suavemente o meio na placa.
4. Encha uma seringa de 10 ml com 10 ml de meio de cultura BMDM fresco e coloque uma agulha de 25 G.
5. Pegue a tíbia usando uma pinça; em seguida, corte a articulação do tornozelo em um ângulo de ~ 45 °.
6. Retire a medula óssea da tíbia.
   1. Segure a tíbia sobre um tubo de 50 mL, com a extremidade estreita da tíbia apontando para baixo. Dispense o meio sobre a tíbia da seringa cheia.
   2. Insira a agulha (suavemente no início) na extremidade superior da medula e dispense a mídia.
   3. Retire a agulha e volte a inserir. Use empurrões curtos e de alta pressão para dispensar a mídia e mover a agulha para a medula.
   4. Assim que a mídia começar a fluir da parte inferior do osso, use empurrões curtos e de alta pressão para continuar a liberar as células. Monitore a cor do osso durante esse processo e, quando o osso estiver branco, descarte-o.
   5. Faça isso para ambas as tíbias.
7. Repita as etapas 5 e 6 acima para os fêmures, cortando a articulação do quadril como a tíbia foi cortada na articulação do tornozelo. Use o mesmo tubo de 50 mL para coletar o meio de cultura BMDM enquanto a medula é lavada.
8. Depois que todos os quatro ossos forem lavados, aspire a medula e o meio do tubo de 50 mL para cima e para baixo 3x através de uma agulha de 18 G em uma seringa de 10 mL, enxaguando as laterais do tubo a cada vez para dispersar a medula.
9. Ajuste o volume final no tubo de 50 mL para 30 mL com meio de cultura BMDM e certifique-se de que as células estejam completamente suspensas.
10. Use um filtro de células de 70 μm para filtrar o meio de cultura BMDM do tubo de 50 mL.
11. Coloque a suspensão celular resultante, que contém as células progenitoras da medula óssea, em três placas de cultura de tecidos de 150 mm, adicionando 10 mL (ou ~ 20 × 10⁶ células) a cada uma. Em seguida, adicione mais 10 mL de meios de cultura BMDM a cada prato. Incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C.

3. Diferenciando os BMDMs e o revestimento para os experimentos

1. Incubar as células progenitoras da medula óssea plaqueadas a 37 °C durante 3 dias. Em seguida, remova cada prato e adicione mais 5-8 mL de meios de cultura BMDM (Tabela 1). Voltar à incubadora a 37 °C.
2. No dia 5 após o plaqueamento inicial, remova cada placa e adicione mais 5 mL de meio de cultura BMDM. Voltar à incubadora a 37 °C.
3. No dia 6, remova cada prato e descarte a mídia. Em seguida, adicione 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) fria (armazenada a 4 ° C) para lavar uma vez. Descarte os 10 mL de lavagem fria de PBS. Em seguida, adicione 10 mL de PBS fresco e frio a cada prato e incube cada prato no gelo por 5 min.
4. Usando um raspador de células, raspe suavemente as células de todos os três pratos em um tubo de 50 mL. Girar suavemente as células a 270 × g a 4 °C durante 5 min; então, descarte o sobrenadante.
5. Adicione 20 mL de meio de cultura BMDM, pipete para cima e para baixo para ressuspender o pellet e conte as células.
   nota: Espera-se que cada camundongo produza aproximadamente 60 × 10 6-100 × 10⁶ células.
6. Planeje o layout da placa de 12 poços para o ensaio de estimulação de morte/inflamação celular in vitro desejado. Planeje colocar 1 × 10⁶ células por poço. Para cada estimulação planejada, inclua pelo menos três réplicas biológicas e coloque um conjunto de poços a serem colhidos em tampão de lise de caspase e um segundo conjunto de poços a serem colhidos em tampão RIPA.
7. A placa 1 × 10⁶ células em 1 mL de meio de cultura BMDM por poço em placas de 12 poços. Cultura durante a noite em incubadora umidificada a 37 °C antes de prosseguir para a avaliação de morte/inflamação celular. Após a incubação durante a noite, remova o meio e adicione 1 mL de PBS quente (37 ° C) a cada poço para lavar as células.
8. Remova a lavagem PBS e adicione 500 μL de meio de estimulação BMDM com antibióticos (se realizar estimulações não bacterianas) ou meio de estimulação BMDM sem antibióticos (se realizar estimulações bacterianas) (Tabela 1). Incube por 2 h antes de passar para a etapa 4 para estimulação / infecção in vitro.

4. Estimulando ou infectando as células

CUIDADO: Os agentes incluídos neste protocolo são potencialmente patogênicos e devem ser manuseados com as devidas precauções em uma instalação de nível de biossegurança 2 (BSL2) com a aprovação das autoridades institucionais e governamentais relevantes.

1. Estimular os BMDMs a ativar a morte celular com o gatilho de interesse.
   nota: Para os fins deste protocolo, o vírus influenza A (IAV), o vírus herpes simplex 1 (HSV1), o novicida Francisella e o LPS + ATP são usados para ilustração, mas outros gatilhos podem ser usados.
   1. Exemplo de estimulação 1: Infectar com IAV (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) (construído de acordo com Hoffmann et al.; o título viral para a determinação da multiplicidade de infecção [MOI] é calculado por um ensaio de placa em células MDCK):
      1. Calcule o volume de vírus necessário para a infecção em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20 unidades formadoras de placas (PFU) usando a equação (1) e a equação (2):
         
         
         
   2. Remova o meio dos BMDMs e lave as células uma vez com 500 μL de PBS. Adicione 450 μL de IAV (20 MOI) em DMEM com alto teor de glicose sem soro fetal bovino inativado pelo calor, (HI)-FBS a cada poço. Incubar as placas a 37 °C durante 1 h numa incubadora humidificada para permitir a absorção.
   3. Remova as placas e adicione 50 μL de HI-FBS. Retorne as placas para a incubadora a 37 °C. Incubar por um total de 12 h.

5. Coletando o sobrenadante combinado e o lisado de proteína a serem usados para western blots de caspase

1. Após 4 h, 12 h ou 16 h de incubação (o tempo específico depende do gatilho usado), remova a placa da incubadora.
2. Remover 150 μL do sobrenadante; descartar ou guardá-lo para outras análises do sobrenadante (por exemplo, ensaio de imunoabsorção enzimática [ELISA]). Não remova o sobrenadante restante.
3. Crie a solução de coleta de proteínas combinando 50 μL de tampão de lise de caspase + 100 μL de tampão SDS 4x por poço (Tabela 1). Em seguida, adicione 150 μL da mistura a cada poço.
4. Para cada alvéolo, pipetar a mistura para cima e para baixo para recolher as células lisadas e o sobrenadante. Durante a pipetagem, raspe também o fundo do poço com a ponta da pipeta para romper as células. Após raspagem e pipetagem, colete o lisado de proteína em tubos rotulados de 1,5 mL.
5. Use um bloco de calor para aquecer todos os tubos a 100 °C por 12 min.
6. Granule quaisquer componentes insolúveis centrifugando a 14.500 × g por 30 s à temperatura ambiente.
   NOTA: Este é um ponto de pausa - a proteína do sobrenadante combinado e dos lisados de proteínas pode ser usada imediatamente ou armazenada a -20 ° C por até 2 meses ou a -80 ° C por até 6 meses até que esteja pronta para uso.

categoria	Reagentes	preparação	Observações	Precauções de segurança
Mídia	Meios de cultura L929	1) Inative o calor FBS (ver observações). 2) Combine 43,5 mL de Meio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM), 5 mL de soro fetal bovino inativado por calor (HI-FBS), 0,5 mL de piruvato de sódio, 0,5 mL de aminoácidos não essenciais e 0,5 mL de penicilina e estreptomicina.	Inative o FBS por incubação a 56 °C por 30 min.
	Meios de cultura de macrófagos derivados da medula óssea (BMDM)	Combine 290 mL de IMDM, 150 mL de meio condicionado por L929 e 5 mL de aminoácidos não essenciais, 50 mL de HI-FBS e 5 mL de penicilina e estreptomicina.	Aqueça o meio a 37 °C em banho-maria ou esfera antes de usar. A mídia pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.
	Meios de estimulação BMDM com antibióticos	Combine 445 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), 50 mL de HI-FBS e 5 mL de penicilina e estreptomicina.	Aqueça o meio a 37 °C em banho-maria ou esfera antes de usar. A mídia pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.
	Meios de estimulação BMDM sem antibióticos	Combine 450 mL de DMEM e 50 mL de HI-FBS.	Aqueça o meio a 37 °C em banho-maria ou esfera antes de usar. A mídia pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.
	Mídia para infecção (sem HI-FBS)	Combine 495 mL de DMEM com alto teor de glicose com 5 mL de penicilina e estreptomicina.	Aqueça o meio a 37 °C em banho-maria ou esfera antes de usar. A mídia pode ser armazenada a 4 °C por até 1 semana.
Tampão dodecil sulfato de sódio (SDS)	1 M Tris buffer (para buffer SDS 4x)	1) Dissolva 12,11 g de Tris em 80 mL de água deionizada. 2) Ajuste o pH para 6,8 adicionando gotas de HCl enquanto mexe. 3) Adicione água deionizada para ajustar o volume final para 100 mL.	O tampão pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.	HCl é cáustico. Use sempre equipamento de proteção individual adequado; Isso incluirá um jaleco e luvas. O HCl deve ser manuseado em uma capela de exaustão.
	4x tampão SDS	1) Combine 60 mL de solução 1 M Tris (pH 6,8), 24 mg de SDS, 100 mg de azul de bromofenol, 120 mL de glicerol, 8,4 mL de β-mercaptoetanol (BME) e 90 mL de água deionizada. 2) Mexa em uma placa de aquecimento para permitir que os sais entrem na solução. 3) Adicione água deionizada para ajustar o volume final para 300 mL.	O tampão pode ser aliquotado e armazenado a -20 °C por até 1 ano.	SDS é cáustico e BME é cancerígeno. Use sempre equipamento de proteção individual adequado; Isso incluirá um jaleco e luvas. SDS e BME devem ser manuseados em uma capela de exaustão.
Tampão de lise de caspase	1 M 1,4-ditiotreitol (TDT)	Dissolva 0,154 g de pó de DTT em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Permita que a TDT entre na solução.	O tampão pode ser aliquotado em alíquotas de 200 μL e armazenado a -20 °C por até 1 ano.
	Tampão de lise de caspase	Combine 35 mL de água deionizada, 4 mL de NP-40, 750 μL de 1 M DTT, 1 comprimido inibidor de protease e 1 comprimido inibidor de fosfatase.	O tampão pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.
Tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA)	1,5 M Tris buffer (para tampão RIPA)	1) Dissolva 18,2 g de Tris em 80 mL de água deionizada. 2) Ajuste o pH para 8,8 adicionando gotas de NaOH enquanto mexe. 3) Adicione água deionizada para ajustar o volume final para 100 mL.	O tampão pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.	O NaOH é corrosivo e pode causar queimaduras. Use sempre equipamento de proteção individual adequado; Isso incluirá um jaleco e luvas.
	Solução de FDS a 10% (peso/vol (para tampão RIPA)	1) Adicione 10 g de SDS a 80 mL de água deionizada. 2) Mexa até dissolver. 3) Adicione água deionizada para ajustar o volume final para 100 mL.	A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 6 meses. Se a solução precipitar, aqueça suavemente para dissolver novamente.	SDS é cáustico. Use sempre equipamento de proteção individual adequado; Isso incluirá um jaleco e luvas. O SDS deve ser manuseado em um exaustor.
	Tampão RIPA (2x estoque)	1) Combine 0,5 g de desoxicolato de sódio, 1 mL de NP-40, 0,876 g de NaCl, 3,3 mL de Tris 1,5 M (pH 8,8) e 1 mL de SDS a 10% (peso / vol) em 46 mL de água deionizada><. 2) Mexa até dissolver. 3) Adicione água deionizada para ajustar o volume final para 50 mL.	2x estoque RIPA pode ser armazenado a 4 °C por até 1 mês.	SDS é cáustico. Use sempre equipamento de proteção individual adequado; Isso incluirá um jaleco e luvas. O SDS deve ser manuseado em um exaustor.
Gatilhos estéreis	Lps	Dissolva o LPS liofilizado de E. coli 0111:B4 em água livre de endotoxinas até uma concentração de 5 mg/mL.	A solução pode ser armazenada a -20 °C por até 2 anos.
	0,5 M ATP	Dissolva 1 g de ATP liofilizado em 3,63 mL de água livre de endotoxinas.	A solução pode ser aliquotada e armazenada a -20 °C por até 2 anos.
Soluções de Western blotting	Executando buffer (5x estoque)	1) Combine 15 g de base Tris, 72 g de glicina e 5 g de SDS em 900 mL de água deionizada. 2) Mexa até que não haja mais partículas. 3) Adicione água deionizada para ajustar o volume final para 1 L.	O tampão pode ser armazenado em temperatura ambiente por até 6 meses.	SDS é cáustico. Use sempre equipamento de proteção individual adequado; Isso incluirá um jaleco e luvas. O SDS deve ser manuseado em um exaustor.
	Tampão de transferência (10x estoque)	1) Combine 30,3 g de base Tris e 72 g de glicina em 900 mL de água deionizada. 2) Mexa até que não haja mais partículas. 3) Adicione água deionizada para ajustar o volume final para 1 L.	O tampão pode ser armazenado em temperatura ambiente por até 3 meses.
	Solução salina tamponada com Tris com Tween 20 (TBST)	1) Dissolver 2,42 g de base Tris e 8,76 g de NaCl em 850 mL de água deionizada. 2) Ajuste o pH para 7,4 adicionando gotas de HCl enquanto mexe. 3) Adicione água deionizada para ajustar o volume final para 1 L. 4) Adicionar 0,5 mL de Tween 20 (concentração final de 0,05% (vol/vol)).	A solução pode ser armazenada em temperatura ambiente por 1 mês.	HCl é cáustico. Use sempre equipamento de proteção individual adequado; Isso incluirá um jaleco e luvas. O HCl deve ser manuseado em uma capela de exaustão.
	Solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso/vol)	Dissolva 5 g de leite em pó desnatado em 100 mL de TBST.	A solução pode ser conservada a 4 °C durante um período máximo de 1 semana.
Anticorpos primários	Anticorpo primário caspase-1	Dilua o anticorpo anti-caspase-1 1:1.000 (vol/vol) adicionando 10 μL do anticorpo a 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso/vol).	Para obter os melhores resultados, faça um novo para cada experimento. No entanto, esta solução pode ser usada pelo menos 3 vezes sem perda de eficácia. Armazene a -20 °C se estiver reutilizando.
	Anticorpo primário caspase-11	Dilua o anticorpo anti-caspase-11 1:1.000 (vol/vol) adicionando 10 μL do anticorpo a 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatada a 5% (peso/vol).	Para obter os melhores resultados, faça um novo para cada experimento. No entanto, esta solução pode ser usada pelo menos 3 vezes sem perda de eficácia. Armazene a -20 °C se estiver reutilizando.
	Anticorpo primário caspase-3	Dilua o anticorpo anti-caspase-3 e o anticorpo anti-caspase-3 clivado 1:1.000 (vol/vol) adicionando 10 μL de cada anticorpo aos mesmos 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso/vol).	Para obter os melhores resultados, faça um novo para cada experimento. No entanto, esta solução pode ser usada pelo menos 3 vezes sem perda de eficácia. Armazene a -20 °C se estiver reutilizando.
	Anticorpo primário caspase-7	Dilua o anticorpo anti-caspase-7 e o anticorpo anti-caspase-7 clivado 1:1.000 (vol/vol) adicionando 10 μL de cada anticorpo aos mesmos 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso/vol).	Para obter os melhores resultados, faça um novo para cada experimento. No entanto, esta solução pode ser usada pelo menos 3 vezes sem perda de eficácia. Armazene a -20 °C se estiver reutilizando.
	Anticorpo primário caspase-8	Dilua o anticorpo anti-caspase-8 e o anticorpo anti-caspase-8 clivado 1:1.000 (vol/vol) adicionando 10 μL de cada anticorpo aos mesmos 10 mL de solução bloqueadora de leite desnatado a 5% (peso/vol).	Para obter os melhores resultados, faça um novo para cada experimento. No entanto, esta solução pode ser usada pelo menos 3 vezes sem perda de eficácia. Armazene a -20 °C se estiver reutilizando.
	Anticorpo primário caspase-9	Dilua o anticorpo anti-caspase-9 1:1.000 (vol/vol) adicionando 10 μL do anticorpo a 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatada a 5% (peso/vol).	Para obter os melhores resultados, faça um novo para cada experimento. No entanto, esta solução pode ser usada pelo menos 3 vezes sem perda de eficácia. Armazene a -20 °C se estiver reutilizando.
	Anticorpo primário de β-actina conjugado com HRP	Dilua o anticorpo anti-β-actina 1:5.000 (vol/vol) adicionando 2 μL do anticorpo a 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso/vol).	Este anticorpo deve ser preparado fresco para cada experiência.
Anticorpos secundários	Anticorpo anti-coelho	Dilua o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) 1:5.000 (vol:vol) adicionando 2 μL do anticorpo a 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso/vol).	A diluição do anticorpo deve ser preparada sempre fresca.
	Anticorpo anti-camundongo	Dilua o anticorpo secundário conjugado com HRP 1:5.000 (vol:vol) adicionando 2 μL do anticorpo a 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso/vol).	A diluição do anticorpo deve ser preparada sempre fresca.
	Anticorpo anti-rato	Dilua o anticorpo secundário conjugado com HRP 1:5.000 (vol:vol) adicionando 2 μL do anticorpo a 10 mL de solução de bloqueio de leite desnatado a 5% (peso/vol).	A diluição do anticorpo deve ser preparada sempre fresca.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de 0,45 μm	Millipore	SCHVU05RE
Seringa de 10 mL	BD Biociências	309604
Placa de 12 poços	Corning	200/07/82
Agulha 18 G	BD Biociências	305195
Agulha de 25 G	BD Biociências	305122
Tubo de 50 mL	Fisher Científico	Telefone: 50-809-218
Filtro de células de 70 μm	Corning	431751
Placas de cultura de tecidos de 150 mm	Corning	430597
Balão de cultura de tecidos de 182 cm2	Genesee Científico	25-211
ATP	InvivoGen	tlrl-atpl
Caldo de soja BBL Trypticase	BD Biociências	211768
Banho de contas	Ciências da Vida Chemglass	CLS-4598-009
Biofotômetro D30	Eppendorf	6133000010
Raspadores de células	Produtos Científicos CellTreat	229315
Câmara de CO2	VetEquip	901703
Cuvetes	Fisher Científico	Telefone: 14-955-129
Tesoura de dissecação	Thermo Fisher Científico	221S
DMEM	Thermo Fisher Científico	11995-073
etanol	Pharmco	111000200
Soro fetal bovino	Biooeste	S1620
Papel de filtro	Bio-Rad	1703965
fórceps	Fisher Científico	22-327379
Francisella novicida (cepa U112)	Recursos do BEI	NR-13
Gentamicina	Gibco	15750060
Bloco de calor	Fisher Científico	23-043-160
Vírus do herpes simples 1 (cepa HF)	ATCC	VR-260
DMEM de glicose alta	sigma	D6171
Incubadora umidificada	Thermo Fisher Científico	51026282
IMDM	Thermo Fisher Científico	Rolamento 12440-053
Vírus da gripe A (A/Porto Rico/8/34, H1N1 [PR8])	construído por Hoffmann et al.
Células L929	ATCC	CCL-1	Linha celular para criação de meios condicionados por L929
L-cisteína	Thermo Fisher Científico	BP376-100
Células MDCK	ATCC	CCL-34	Linhagem celular para determinação do título viral do IAV
Microcentrífuga	Thermo Fisher Científico	75002401
Aminoácidos não essenciais	Gibco	11140050
Solução NP-40	sigma	492016
Pbs	Thermo Fisher Científico	10010023
Penicilina e estreptomicina	sigma	Pág. 4333
Placa de Petri	Fisher Científico	07-202-011
PhosSTOP	Roche	PHOSS-RO
Fonte de energia	Bio-Rad	164-5052
Comprimido inibidor de protease	sigma	S8820
hidróxido de sódio	sigma	Nº 72068
Piruvato de sódio	Gibco	Rolamento 11360-070
Placa de Petri quadrada	Fisher Científico	FB0875711A
Centrífuga de mesa	Thermo Fisher Científico	75004524
Lipopolissacarídeo ultrapuro (LPS) de E. coli 0111:B4	InvivoGen	tlrl-3pelps
Células Vero	ATCC	CCL-81	Linhagem celular para determinação do título viral do HSV1