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Todos os procedimentos que envolvem coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Análise de citocinas lacrimais
- Coleção de lágrimas:
- Peça ao sujeito para se sentar confortavelmente em uma cadeira de exame e colocar a cabeça contra o encosto de cabeça.
- Peça ao sujeito para olhar para cima, abra cuidadosamente as tiras de Schirmer (feitas de papel de filtro Whatman nº 41), coloque a extremidade arredondada da tira no fórnice inferior do olho e instrua o sujeito a fechar os olhos por 5 min. Ao coletar as lágrimas, tome muito cuidado para minimizar o contato com a superfície ocular.
- Peça ao sujeito para abrir os olhos para remover a tira e colocá-la em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL. Transfira imediatamente o tubo para o laboratório ou armazene-o a -80 oC até o teste de perfil de citocinas.
- Eluição da amostra de lágrima da tira de fluxo lacrimal:
- Corte a tira de fluxo lacrimal em um comprimento de 0,5 cm (para padronizar a quantidade de lágrimas a serem testadas) e coloque-a em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.
- Adicione 30 μL de tampão de ensaio e incube à temperatura ambiente por 5 min, seguido de centrifugação do tubo a 14.000 x g por 1 min.
- Transfira o sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e descarte a tira. Coloque a amostra contendo o tubo no gelo e use a amostra lacrimal eluída imediatamente para o perfil de citocinas.
- Preparação de reagentes:
NOTA: Os quarenta e um analitos a serem testados em cada amostra por ensaio multiplex baseado em esferas são interleucina (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, IL-12 p70, IL-13, IL-15, IL-17A, interferon-alfa (IFN-α) 2, IFN-γ, proteína 10 induzível por IFN-gama (IP-10, CXCL10), quimiocina derivada de macrófagos (MDC), proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-1α e MIP-1β, proteína quimiotática de monócitos (MCP)-1, MCP-3, fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), TNF-β, oncogene regulado por crescimento (GRO), fator de crescimento tumoral alfa (TGF-α), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF)-2, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), eotaxina, fractalina, ligante CD40 solúvel (sCD40L), ligante tirosina quinase 3 semelhante a Fms (Flt-3L) e regulado após ativação, proteína expressa e secretada de células T normais (RANTES).
- Leve os frascos de solução de anticorpo (50X) à temperatura ambiente (20 – 25 oC) e vortex os frascos por 1 min.
- Conte o número de poços necessários para o ensaio e calcule a quantidade de solução total de coquetel de anticorpo (25 μL por poço) e cada solução de anticorpo (50X) necessária para o ensaio.
- Prepare a solução de coquetel adicionando a quantidade calculada de cada solução de grânulo de anticorpo e encha até o volume final desejado adicionando a quantidade restante de diluente de grânulo. Certifique-se de que a concentração final de cada anticorpo no coquetel seja 1X. Sempre prepare pelo menos 20% de volume extra de solução de coquetel em caso de erros de pipetagem.
nota: Por exemplo, para um ensaio de 96 poços, prepare 3000 μL de solução de coquetel de anticorpos. A quantidade necessária de cada solução de grânulo de anticorpo = 3000/concentração de estoque de cada solução de grânulo de anticorpo; 3000/50 = 60 μL de cada solução de esferas de anticorpo
- Adicione 60 μL de cada uma das 41 soluções de esferas de anticorpos (60 X 41 = 2460 μL) em um frasco de coquetel e adicione 540 μL de solução diluente de esferas à mistura de esferas de anticorpos para fazer 3000 μL de solução de trabalho final (1X).
- Antes de usar, misture a solução de coquetel de contas corretamente. Após o ensaio, armazene o volume restante a 2-8 oC por até 30 dias.
- Prepare os controles de qualidade (CQ) adicionando 250 μL de água deionizada aos estoques de CQ 1 e CQ 2.
- Misture bem invertendo as garrafas várias vezes e agitando por 10 segundos. Transfira a solução para tubos de microcentrífuga de polipropileno devidamente rotulados e armazene a solução restante a -20 oC, que pode ser usada por até 30 dias.
- Prepare o tampão de lavagem adicionando 270 mL de água deionizada a 30 mL de solução tampão de lavagem 10X e misture bem (antes da diluição, leve o tampão 10X à temperatura ambiente e dissolva todos os precipitados de sal misturando). Armazene o tampão de lavagem não utilizado (1X) a 2-8 oC, que pode ser usado por até 30 dias.
- Prepare o estoque padrão de citocinas humanas (10.000 pg / mL de todos os analitos) adicionando 250 μL de água deionizada ao frasco de estoque. Misture bem invertendo várias vezes e agitando o frasco por 10 segundos. Deixe repousar por 10 min e transfira a solução estoque para tubos de microcentrífuga de polipropileno devidamente rotulados. Após o ensaio, armazene a solução restante a -20 oC, que pode ser usada por até 30 dias.
- Prepare os padrões de citocinas humanas em funcionamento por diluições seriais de 5 vezes (50 μL -> 200 μL) com tampão de ensaio para obter 2000, 400, 80, 16 e 3,2 pg/mL.
- Após a preparação padrão, use os padrões de trabalho dentro de 60 min e use o tampão de ensaio como branco/fundo (-pg/mL).
- Perfil de citocinas por ensaio multiplex baseado em esferas:
- Leve todos os reagentes à temperatura ambiente e vórtice por 5 a 10 segundos antes de adicioná-los à placa de microtitulação de 96 poços. Se as amostras de lágrimas eluídas forem armazenadas a -80 oC antes do ensaio, descongele os extratos lacrimais congelados em gelo e centrifugue a 1000 X g por 5 min.
- Prepare uma planilha de ensaio em uma configuração vertical para padrões de citocinas humanas de trabalho [0 (em branco), 3.2, 16, 80, 400, 2.000 e 10.000 pg/mL], QC1, QC2 e amostras.
- Adicione 200 μL de tampão de lavagem 1X a cada poço da placa, sele-o com um selador de placas e mantenha-o em um agitador de placas em temperatura ambiente (20-25 oC) por 10 min.
- Transvase o tampão de lavagem 1X invertendo a placa e colando-a em toalhas absorventes várias vezes para remover qualquer quantidade residual de tampão de lavagem nos poços.
- Adicione 25 μL de cada padrão de citocina humana em funcionamento, QC1, QC2, em branco (tampão de ensaio) e amostras nos poços apropriados.
- Adicione 25 μL de tampão de ensaio em cada poço.
- Adicione 25 μL de solução de coquetel de esferas de anticorpo 1X em cada poço. Como a solução de cordão de anticorpo é sensível à luz, sele a placa com um selador de placas e cubra-a com papel alumínio para protegê-la da luz durante o ensaio.
- Incube a placa a 4 oC durante a noite em uma coqueteleira.
- Coloque a placa no suporte de placas de uma arruela de placas magnética automática. Deixe descansar por 1 minuto para assentar as contas magnéticas no fundo do poço e aspirar o conteúdo do poço. Adicione 200 μL de tampão de lavagem por poço, deixe descansar por 1 min e aspire o conteúdo do poço. Repita a lavagem mais uma vez (para lavar pratos, siga as instruções do fabricante do kit).
- Adicione 25 μL de solução de anticorpos de detecção em cada poço, sele a placa, cubra-a com papel alumínio e incube em temperatura ambiente por 60 min em um agitador.
- Adicione 25 μL de solução de estreptavidina-ficoeritrina em cada poço, feche a placa, cubra-a com papel alumínio e incube em temperatura ambiente por 30 min em um shaker.
- Coloque a placa em uma arruela de placa magnética. Deixe descansar por 1 minuto e depois aspire o conteúdo do poço. Adicione 200 μL de tampão de lavagem por poço. Deixe descansar por 1 minuto e depois aspire o conteúdo do poço. Repita a lavagem mais uma vez.
- Adicione 150 μL de fluido de bainha a cada poço e coloque a placa em um agitador por 5 min em temperatura ambiente para ressuspender os grânulos de anticorpos.
- Leia a placa imediatamente usando o leitor de placas de ensaio multiplex baseado em esferas e analise as concentrações de citocinas usando um algoritmo de ajuste de curva de 5 parâmetros. Um diagrama de fluxo esquemático do perfil de citocinas lacrimais é mostrado na Figura 1.
- Leitura da placa de ensaio (configuração do instrumento) e análise dos dados:
- Ligue o leitor de ensaio multiplex baseado em esferas e pré-aqueça o laser por 30 min.
- Inicie o software de ensaio multiplex baseado em esferas. Na guia 'Manutenção automatizada', selecione a opção 'Verificação de calibração'. Vortex cada frasco de reagente das esferas de calibração e verificação por 30 segundos. Coloque 5 gotas de cada reagente nos poços designados. Encha os reservatórios designados com água deionizada e etanol 70%.
