Usando hibridização in situ de fluorescência de imuno-RNA para visualizar o SARS-CoV-2

1. SARS-CoV-2 RNA-FISH em células Vero cultivadas em lamínulas

DIA 1

1. Fixação e permeabilização de células
   1. Fixe as células infectadas com solução de PFA a 3,7% p / v por 1 h em RT.
   2. Aspire a solução de PFA a 3,7% e lave as células duas vezes usando 1x PBS.
   3. Permeabilize as células com solução de PBST por 10 min em RT com agitação.
   4. Aspire o PBST e lave as células duas vezes com 1x PBS.
2. detecção
   1. Aspire a solução 1x PBS e lave as células duas vezes com 2x SSC em RT.
   2. Aspire a solução 2x SSC e pré-hibridize as amostras adicionando pelo menos 300 μL de tampão de hibridização da sonda. Cobrir os alvéolos que contêm as células e incubar a 37 °C durante 30 min.
   3. Prepare a solução da sonda adicionando 1,2 pmol de mistura de sonda ao tampão de hibridização da sonda.
      1. Use 1,2 μL do estoque de sonda de 1 μM para preparar 300 μL de estoque de trabalho.
   4. Remova a solução de pré-hibridização e transfira as lamínulas para uma câmara umidificada.
      1. Pipetar 30-50 μL de solução de sonda em parafilme para formar gotículas individuais.
   5. Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) a 37 °C.

DIA 2

1. Transfira as lamínulas de volta para uma placa de 12 poços e remova o excesso de solução da sonda lavando por 4 x 5 min com 400 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C.
   nota: Como alternativa à colocação de alíquotas de 30-50 μl no parafilme e sob lamínulas para incubação, adicione 300 μL de solução de sonda diretamente às lamínulas em uma placa de 12 poços. Este procedimento é mais simples, mas requer quantidades substanciais de reagentes. Aqueça o tampão de lavagem da sonda a 37 °C antes de usar. Calcule a quantidade de tampão necessária e transfira-a para um tubo de centrífuga cônico de 15 mL.
2. Lave as amostras por 2 x 5 min com 5x SSCT em RT.
3. Substituir a solução de 5x SSCT por 1x PBS e armazenar as amostras a 4 °C até à amplificação.

3. Amplificação

1. Remova a solução 1x PBS dos poços e adicione pelo menos 300 μL de tampão de amplificação a cada poço. Incubar as amostras durante 30 minutos à RT.
2. Prepare cada grampo de cabelo HCR (h1 e h2) resfriando o volume desejado em tubos separados.
   1. Para preparar 300 μL de solução de amplificação, use 18 pmol de cada grampo de cabelo (por exemplo, para 300 μL, use 6 μL de uma solução de grampo de cabelo de 3 μM).
   2. Transfira a solução em grampo para tubos.
   3. Incubar a 95 °C durante 90 s.
   4. Deixe esfriar para RT por 30 minutos no escuro.
3. Prepare uma mistura de grampos de cabelo adicionando os grampos de cabelo "h1" e "h2" resfriados por pressão ao tampão de amplificação.
4. Coloque gotas de 30-50 μL da mistura de grampo de cabelo no parafilme.
5. Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) no escuro em RT.

DIA 3

1. Transfira as lamínulas de volta para a placa de 12 poços e remova o excesso de grampos de cabelo lavando por 5 x 5 min com 5x SSCT em RT com agitação.
2. Aspire o tampão SSCT 5x e substitua-o por 1x PBS.
   nota: Se necessário, utilizar as amostras de RNA-FISH num ensaio de imunofluorescência padrão, seguido de coloração dos núcleos (ver secção 1.4).

4. Coloração nuclear e montagem em lâminas

1. Aspire a solução 1x PBS e substitua-a por 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0,2 μg/mL) em solução 1x PBS.
2. Incube as amostras por 10 min em RT no escuro.
3. Aspire a solução de DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
4. Colocar duas gotas de 10 μL de cada meio de montagem; certificar-se de que as gotas estão suficientemente separadas para permitir a colocação de duas lamínulas numa única lâmina.
5. Remova o excesso de líquido batendo as lamínulas em uma toalha limpa e, em seguida, coloque-as em um meio de montagem antidesbotamento com as células voltadas para baixo.
6. Coloque as amostras montadas em uma superfície plana e seca no escuro e deixe-as curar.
7. Após a cura, sele as bordas das lamínulas com selante VALAP ou esmalte para evitar que as amostras sequem.

2. RNA-FISH SARS-CoV-2 em culturas de AEH

DIA 1

1. Fixação e permeabilização da cultura de AEH
   1. Aspire o meio e fixe as células infectadas usando solução de PFA a 3,7% por 1 h em RT.
   2. Aspire a solução de PFA a 3,7% e lave as células duas vezes com 1x PBS.
      1. Substitua a solução de PFA a 3,7% por 1x PBS sob uma inserção Transwell.
   3. Descarte o PBS e desidrate as amostras usando lavagens de 2 x 5 min com 100% de MeOH pré-resfriado a -20 °C.
   4. Após a segunda lavagem, substitua o tampão por MeOH fresco e resfriado para permeabilização sob o inserto Transwell. Conservar durante a noite a -20 °C.

DIA 2

2. Reidratação
   Reidrate as amostras por meio de uma série graduada de soluções de MeOH/PBST (cada uma por 5 min) no gelo: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS e 100% PBST (duas vezes).
   1. Lave as células por 5 min no gelo com 50% 5x SSCT / 50% PBST.
   2. Lave as células por 5 min no gelo com 5x SSCT.
   3. Substitua o buffer SSCT 5x por 1x PBS.
3. detecção
   1. Incube as células (dentro do inserto Transwell) por 5 min em gelo com 100 μL de tampão de hibridização da sonda. Em seguida, transferir a placa para uma incubadora por 30 minutos a 37 °C (pré-hibridização).
      nota: O tampão de hibridização da sonda deve ser pré-aquecido a 37 °C antes do uso. Calcule o volume necessário: 100 μL são necessários para um único inserto Transwell.
   2. Prepare a solução da sonda. Como 1 mL de solução de sonda requer 4 pmol de sonda, adicione 4 μL de solução estoque de sonda de 1 μM a 1 mL de tampão de hibridização da sonda e misture bem.
      nota: Para detecção de RNA, use 100 μL de solução de sonda por inserto Transwell. Deixe a solução da sonda no gelo até o final da etapa de pré-hibridização.
   3. Remova a solução de pré-hibridização e adicione a solução de sonda.
   4. Incubar as células durante a noite (12-18 h) a 37 °C.

DIA 3

1. Remova o excesso de sonda lavando por 4 x 15 min com 100 μL de tampão de lavagem da sonda a 37 °C.
2. Lave as amostras por 2 x 5 min com 5x SSCT em RT.
3. Substitua o SSCT 5x por 1x PBS e armazene as amostras a 4 °C até a amplificação.

4. amplificação

1. Pré-amplificar as amostras incubando-as com um tampão de amplificação por 30 min em RT.
2. Prepare cada grampo de cabelo resfriando os volumes desejados em tubos separados.
   1. Para preparar 500 μL de solução de amplificação, use 30 pmol de cada grampo de cabelo (por exemplo, para 500 μL, use 10 μL de solução de grampo de estoque de 3 μM).
   2. Transfira a solução de grampo de cabelo para os tubos.
   3. Incubar a 95 °C durante 90 s.
   4. Deixe esfriar para RT por 30 minutos no escuro.
3. Prepare a solução de grampo de cabelo adicionando todos os grampos de cabelo resfriados a 500 μL de tampão de amplificação em RT.
4. Remova a solução de pré-amplificação e adicione a solução completa de grampo de cabelo.
5. Incubar as amostras durante a noite (12-18 h) em RT no escuro.
6. Remova o excesso de grampos de cabelo lavando com 5x SSCT em RT da seguinte forma: 2 x 5 min, 2 x 15 min e 1 x 5 min.
7. Substitua a solução 5x SSCT por 1x PBS e armazene a 4 ° C por não mais de 2-3 dias, ou prossiga diretamente para a coloração nuclear.
   nota: Se necessário, utilizar as amostras de RNA-FISH num ensaio de imunofluorescência padrão, seguido de coloração nuclear (ver secção 3).

5. Coloração nuclear e montagem em lâminas

1. Aspire a solução 1x PBS e substitua-a por solução DAPI (0,2 μg/mL) em 1x PBS.
2. Incube as amostras por 10 min em RT no escuro.
3. Aspire a solução de DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
4. Coloque a membrana recortada das inserções Transwell em 10 μL de meio de montagem antidesbotamento com as células voltadas para cima e adicione meio de montagem extra (5 μL) à membrana.
5. Cubra as membranas com lamínulas.
6. Cure as amostras montadas em uma superfície plana e seca no escuro.
7. Após a cura, sele as bordas das lamínulas com selante VALAP ou esmalte para evitar que as amostras sequem.

3. Análise de imunofluorescência de células Vero e culturas de AEH

NOTA: Realize o ensaio de imunofluorescência no dia 3 para linhagens celulares ou no dia 4 para culturas de AEH. Use uma abordagem diferente para cada modelo. Todas as diferenças são indicadas claramente.

1. Aspire a solução 1x PBS dos poços.
2. Bloquear as amostras por incubação com albumina de soro bovino a 1% p/v em solução de PBST durante 30 min a 37 °C.
3. Preparar os anticorpos primários preparando diluições apropriadas na solução de bloqueio e incubar.
   1. Para células Vero em lamínulas:
      1. Coloque gotas (30-50 μL) de solução de anticorpos no parafilme em uma câmara de umidade.
      2. Coloque lamínulas nas gotas de anticorpos com as células voltadas para baixo.
   2. Para AEH, substitua o agente bloqueador nas bulas por solução de anticorpos (100 μL) e incube as amostras em uma câmara umidificada.
      NOTA: Ajuste o tempo e a temperatura para cada incubação com o anticorpo primário. Os parâmetros típicos são 2 h em RT ou durante a noite a 4 °C.
4. Lave as amostras por 3 x 5 min com PBST.
   1. Para células em lamínulas, transfira para uma placa de 12 poços e adicione a solução PBST.
   2. Para culturas de AEH, substitua a solução de anticorpos pela solução de PBST.
5. Verifique as fontes de luz e filtros disponíveis para o microscópio confocal.
6. Escolha anticorpos secundários de acordo com a espécie hospedeira. Escolha os parâmetros do fluoróforo (comprimentos de onda de excitação e emissão, largura do espectro e eficiência de excitação de acordo com a fonte de luz disponível).
   nota: Os parâmetros espectrais podem ser modelados usando ferramentas online (consulte Tabela de Materiais).
7. Preparar soluções de anticorpos secundários apropriadas, diluindo-as com uma solução de bloqueio.
8. Incubar com anticorpos secundários (como em 6.3), mas incubar durante 1 h a 37 °C.
9. Lave as amostras como na etapa 3.4.
10. Coloração nuclear e montagem em lâmina
    1. Para células em lamínulas
       1. Aspire o PBST e substitua-o por DAPI (0,2 μg/mL) em 1x solução de PBS.
       2. Incube as amostras por 10 min em RT no escuro.
       3. Aspire a solução de DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
       4. Coloque as lamínulas em gotas de 10 μL de meio de montagem com as células voltadas para baixo.
       5. Sele as lamínulas com esmalte.
    2. Para culturas de AEH
       1. Aspire o 1x PBST e substitua-o por DAPI (0,2 μg/mL) em solução 1x PBS.
       2. Incube as amostras por 10 min em RT no escuro.
       3. Aspire a solução de DAPI e lave as células duas vezes com 1x PBS.
       4. Coloque as membranas recortadas em gotas de 10 μL de meio de montagem com as células voltadas para cima e adicione um meio de montagem extra (5 μL) à membrana.
       5. Cubra as membranas com lamínulas.
       6. Sele as lamínulas com esmalte.

4. Microscopia confocal

1. Defina as trilhas especificando os fluoróforos usados.
2. Escolha o modo de digitalização e a velocidade.
3. Ajuste os valores de potência, ganho e deslocamento do laser para cada fluoróforo, comparando-os com os respectivos controles negativos: para vírus, células infectadas por simulação; para proteínas celulares, amostras coradas com anticorpos de controle de isotipo de um hospedeiro apropriado.
4. Para adquirir uma imagem 3D, ative o modo z-stack e defina os limites superior e inferior. Defina o tamanho/número da etapa.
   nota: Para obter mais detalhes sobre imagens de coronavírus.