Todos os vírus da gripe devem ser manuseados de acordo com os requisitos de nível de biossegurança apropriados (BSL-2 ou superior), conforme definido na Biossegurança em Laboratórios Microbiológicos e Biomédicos (BMBL).
1. Preparação de reagentes e material de partida
- Preparar células Madine Darby Canine Kidney-α2,6-sial transferase (MDCK-SIAT1) e meio de cultura de células estéreis
- Prepare o meio de cultura de células MDCK-SIAT1 usando 500 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com glicose alta, 10% v / v de soro fetal bovino inativado por calor (FBS), 2 mM L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 1 mg / mL de sulfato G418 (por exemplo, geneticina) e 100 U / ml de penicilina com 100 μg / mL de estreptomicina (opcional). Esterilize por filtração através de uma membrana de tamanho de poro de 0,2 μM. O sulfato G418 é adicionado para garantir a estabilidade do plasmídeo nas células MDCK-SIAT1.
- Preparar a linhagem celular MDCK-SIAT1. Num balão decultura de tecidos 2 de 162 cm contendo 30 ml de meios de cultura de células estéreis, semear frascos com 2 - 2,5 x 106 células MDCK-SIAT1 e incubar a 37 °C em CO2 a 5% durante 2 dias; este será usado para determinação da dose infecciosa de cultura de tecidos (TCID) e ensaios de MN.
nota: As células MDCK-SIAT1 foram gentilmente cedidas pelo Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemanha. Esta linhagem celular também pode ser obtida comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
- Prepare o meio de propagação do vírus estéril usando 500 mL de DMEM com alto teor de glicose, 0,3% de albumina de soro bovino (BSA) fração V, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina e 20 mM de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES). Esterilize por filtração através de uma membrana de tamanho de poro de 0,2 μM.
- Prepare 0,75% (v / v) de glóbulos vermelhos de cobaias (gpRBCs) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 0,01 M PBS, a pH 7,2.
- Prepare o diluente do vírus estéril usando DMEM com glicose alta, 1% de Fração V de Albumina Bovina (BSA), 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina e 20 mM de HEPES. Esterilize por filtração com uma membrana de tamanho de poro de 0,2 μm e prepare fresco para cada ensaio.
- Prepare o fixador de célula fria como acetona fria a 80% em PBS (0,01 M PBS, pH 7,2).
- Prepare o tampão de lavagem usando PBS (0.01 M PBS pH 7.2) e 0.3% (v/v) tween-20.
- Prepare o diluente de anticorpos usando PBS (0,01 M PBS, pH 7,2), 0,3% (v / v) tween-20 e 5% de leite em pó desnatado.
- Use os clones de anticorpos monoclonais de camundongo NP anti-influenza A A1 e A3 como anticorpo primário. Diluir no diluente de anticorpos na concentração óptima determinada por titulação.
- Use IgG anti-camundongo de cabra conjugada à peroxidase de rabanete (HRP) como anticorpo secundário. Diluir no diluente de anticorpos na concentração óptima determinada por titulação.
- Preparar o substrato da peroxidase utilizando dicloridrato de ofenilenodiamina (OPD) em tampão citrato de fosfato 0,05 M a pH 5. Prepare o tampão citrato de fosfato 0,05 M dissolvendo 1 cápsula / 100 mL de H2O. Dissolva 1 comprimido de OPD (10 mg) / 20 mL de tampão citrato de fosfato imediatamente antes do uso.
- Use 0,5 M de ácido sulfúrico como solução de parada OPD. Adicione 28 mL de estoque de ácido sulfúrico 18 M a 972 mL de H2O deionizado em uma capa química.
- Tratamento de soros humanos e animais
- Inativar o calor dos soros humanos utilizados nos ensaios MN em banho-maria a 56 °C durante 30 minutos antes do ensaio. Utilizar imediatamente ou, se necessário, conservar os soros descongelados a 4 °C durante um máximo de 24 h; se for necessário um período de armazenamento mais longo, conservar os soros congelados a -20 °C ou mais frios.
- Trate os soros animais usados nos ensaios MN com a enzima destruidora do receptor (RDE) e inative o calor antes do ensaio da seguinte forma.
- Descongelar os soros num banho-maria a 37 °C e colocá-los sobre gelo. Misturar 1 volume de amostra de soro animal com 3 volumes de RDE. Incubar a 37 °C durante 18 - 20 h.
- Inativar o calor dos soros tratados com RDE a 56 °C durante 30 minutos. Adicionar 6 volumes de PBS, pH 7,2, a cada amostra para uma pré-diluição final de 1:10. Se necessário, conservar os soros descongelados a 4 °C durante um máximo de 24 horas; se for necessário um período de armazenamento mais longo, armazene os soros congelados a -20 °C ou mais frio.
nota: Os soros animais podem conter vários glicanos de ácido siálico que podem se ligar às hemaglutininas ou HAs dos vírus influenza e inibir a ligação de anticorpos anti-HA específicos para influenza. Portanto, é necessário tratar RDE todos os soros animais antes dos ensaios de MN para remover esses aglutinantes virais inespecíficos de HA nas amostras de soro.
2. Passagem da cultura de células MDCK-SIAT1
NOTA: Todas as culturas de células devem ser realizadas em uma cabine de segurança biológica para evitar contaminação.
- Decantar o meio de cultura celular da monocamada de células em balões de 162 cm2. Tripsinizar as células enxaguando a monocamada com ácido tetracético tripsina-etilenodiamina (EDTA). Adicione 5 mL de tripsina-EDTA para cobrir a monocamada celular. Incubar a 37 °C, 5% de dióxido de carbono, CO2 até que a monocamada se desprenda (5-10 min). Adicione 15 mL de meio de cultura de células MDCK-SIAT1 a cada frasco contendo células tripsinizadas e pipete para cima e para baixo para separar as células.
- Use um hemocitômetro e azul de tripano para determinar a contagem de células e a viabilidade. Semear as células em novos frascos de cultura de tecidos de 162 cm2 contendo 30 ml de meios de cultura de células com 2-2,5 x 106 células/balão e incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 2 dias para utilização em ensaios TCID e MN. Células de sementes a 4 - 5 x 106 células/frasco e incubar a 37°C com 5% de CO2 por 2 dias para uso na propagação de vírus.
nota: A densidade de semeadura pode ser ajustada se forem desejados períodos de cultura mais curtos ou mais longos. Para propagação do vírus, as células devem atingir mais de 100% de confluência. Para ensaios de Dose de Infecção de Cultura de Tecidos (TCID) e MN, as células devem estar em 75 - 95% de confluência (Figura 1).
3. Propagação de vírus A(H3N2) em células MDCK-SIAT1
NOTA: O vírus A(H3N2) pode ser propagado em ovos de galinha embrionados de 10 a 11 dias de idade de acordo com o protocolo padrão ou em culturas de células MDCK-SIAT1. As células MDCK-SIAT1 devem atingir mais de 100% de confluência para inoculação do vírus. Os estoques de sementes de vírus podem ser inoculados com múltiplas diluições de inóculo. As diluições de inóculo com o melhor AH de colheita e infectividade podem ser usadas para outros ensaios de MN.
- Remover o meio de cultura celular da monocamada de células (>100% de confluência) em balões de 162 cm2. Lave a monocamada duas vezes com 15 mL de PBS estéril 0,01 M, pH 7,2 e transvase.
- Rotular 1 balão como controlo e adicionar 20 ml de meios de propagação do vírus. Incubar o balão a 37 °C com 5% de CO2. Deixe este frasco intocado e use-o para comparação após o dia 1 de propagação do vírus.
- Adicionar 10 ml de meios esterilizados de propagação do vírus ao(s) frasco(s) e incubar o(s) frasco(s) a 37 °C, CO5% 2. Descongele um frasco de caldo de vírus influenza em temperatura ambiente e coloque no gelo. Diluir com os meios de propagação do vírus até as diluições desejadas.
nota: As diluições alvo podem ser ajustadas com base nos títulos de HA dos estoques de vírus. Para preparar um inóculo diluído 1:1000, adicione 100 μL de vírus a 9,9 mL de meios estéreis de propagação do vírus. Inverter suavemente, remover 1 ml de diluição a 1:100 para 9 ml de meios estéreis de propagação do vírus e inverter suavemente para obter um inóculo diluído a 1:1000. Coloque no gelo.
- Remova todos os frascos, exceto o frasco de controle, da incubadora. Remover o meio de propagação do vírus do(s) frasco(s) de células MDCK-SIAT1 e inocular cada frasco com 10 ml de vírus diluído. Incubar os balões a 37 °C, 5% de CO2 durante 1 h, rodando o(s) frasco(s) de 15 em 15 minutos.
- Remover 5 ml de inóculo do(s) frasco(s) e substituí-los por 15 ml de meios de propagação do vírus contendo 1 μg/ml de tripsina tratada com tosilfenilalanilclorometilcetona (TPCK-tripsina). Incubar o(s) frasco(s) a 37 °C, 5% de CO2 durante 16-18 h.
- Após a incubação durante a noite, observe o(s) frasco(s) sob ampliação microscópica de 100X e procure efeitos citopáticos (CPE) nas células. Remover 15-17 ml de sobrenadante do vírus do(s) frasco(s) e substituí-lo por 15-17 ml de meios de propagação do vírus recentemente preparados contendo 2 μg/ml de TPCK-tripsina.
- Incubar os frascos a 37 °C, 5% de CO2. Monitore o CPE da monocamada (por comparação com o frasco de controle da célula) e verifique o AH periodicamente (a cada 4 h) com 0,75% de gpRBC até a colheita.
- Configure uma placa de microtitulação de 96 poços de HA. Adicionar 50 μL de PBS 0,01 M, pH 7,2 aos poços A2 - A12 e B2 - B12 (duplicados) e poços H1 - H12 para controle.
- Adicione 100 μL de sobrenadante do vírus a A1 e A2 e execute uma diluição serial de 2 vezes de A1 e B1 a A12 e B12. Rejeitar 50 μL após misturar em A12 e B12. Adicione 50 μL de 0,75% de gpRBCs às linhas A, B e H.
- Bata na placa e incube em temperatura ambiente por 1 h.
- Determine o HA do sobrenadante do vírus inclinando a placa de microtitulação de 96 poços em um ângulo de 45 ° a 60 °.
- Leia as placas para hemaglutinação; a maior diluição do vírus que atinge a hemaglutinação completa é considerada o ponto final de titulação de HA para o vírus específico. Registre o recíproco da maior diluição do vírus com hemaglutinação completa como o título de HA do vírus.
nota: As hemácias assentadas na fileira H (controles) devem começar a "correr" e formar uma pequena forma de lágrima devido à gravidade. Aguarde até que os eritrócitos nos poços de controle terminem de funcionar e, em seguida, leia os botões de hemácias nos poços de titulação do vírus. Aqueles que exibem botões de hemácias e "correm", não atingem hemaglutinação. Localize a maior diluição do vírus que inibe completamente a hemaglutinação como o título de HA do desfecho.
- Colha o vírus quando o HA da cultura do vírus se estabilizar ou a cultura do vírus atingir o HA alvo (por exemplo, unidade de >16 HA), mas antes que a monocamada da célula comece a exibir CPE significativo.
- Centrifugar o sobrenadante da cultura do vírus a 300 x g durante 10 min a 4 °C para sedimentar os restos celulares. Transfira o sobrenadante clarificado contendo a colheita do vírus para um tubo limpo. Alíquota do sobrenadante contendo o vírus é colhido em frascos criogênicos estéreis de uso único e congela imediatamente a -70 °C ou mais.
nota: Os estoques de vírus usados para os ensaios de MN devem ter alto título infeccioso e partículas defeituosas mínimas. A diluição mínima dos estoques de vírus para atingir 100 TCID50/50 μL para o ensaio MN é de 1:100.
nota: Os estoques de vírus usados nos ensaios MN não devem ser descongelados e congelados novamente.
4. Determinação da TCID do vírus
- Dia 1: Titulação do vírus
- Descongele um frasco do vírus em temperatura ambiente e coloque-o imediatamente no gelo.
- Teste o vírus em duas diluições iniciais diferentes: 10-2 e 10-3. Adicione 100 μL de vírus a 9,9 mL de diluente de vírus para diluição de 10-2. Adicione 1 mL de diluição 10-2 a 9,0 mL de diluente de vírus para diluição 10-3.
- Usando duas placas de microtitulação (placa 1 para diluição 10-2 e placa 2 para diluição 10-3), adicione 100 μL de diluente de vírus a todos os poços, exceto a coluna 1 da placa de microtitulação de 96 poços.
- Execute 1/2log10 diluições (10-2, 10-2,5, 10-3, etc.). Adicionar 146 μl da diluição inicial do vírus a todos os alvéolos da coluna 1 e transferir 46 μl em série da coluna 1 para a coluna 11 (figura 2). Troque as pontas das pipetas entre os poços. Depois de misturar a coluna 11, rejeitar as pontas com a diluição de 46 μl.
- Use a coluna 12 como o Controle de Célula (CC); ele contém apenas diluente de vírus. Incubar durante 1 h a 37 °C, 5% CO2.
- Dia 1: Preparação de células MDCK-SIAT1
nota: A monocamada de células MDCK-SIAT1 deve atingir 75 - 95% de confluência para TCID e MN Um frasco de162 cm 2 a 95% de confluência deve produzir células suficientes para semear ~ 4 - 5 placas de microtitulação.
- Lave a monocamada confluente de 75 a 95% com 20 mL de PBS para remover o FBS nos meios de cultura. Tripsinize as células da seguinte maneira.
- Enxágue a monocamada com PBS estéril e adicione 7 mL de tripsina-EDTA para cobrir a monocamada celular. Colocar o balão na horizontal e incubar a 37 °C, 5% de CO2 até que a monocamada se desprenda (aproximadamente 5 - 10 min). Adicionar 7 ml de diluente de vírus a cada frasco que contenha as células tripsinizadas.
- Lave as células com diluente de vírus para remover o FBS.
- Pipete suavemente para cima e para baixo para separar as células. Transfira as células para um tubo cônico de 50 mL; Encha o tubo com diluente de vírus.
- Centrifugue a 485 x g por 5 min. Transvase o diluente do vírus, substitua-o por 50 mL de diluente de vírus fresco e centrifugue a 485 x g por 5 min. Transvase o diluente de vírus e substitua-o por diluente de vírus fresco (10 mL / frasco) para ressuspender o pellet.
- Use um hemocitômetro e azul de tripano para determinar a contagem e a viabilidade das células. Ajuste a concentração celular com o diluente do vírus para 1,5 x 105 células/mL.
- Adicione 100 μL de células MDCK-SIAT1 diluídas a cada poço das placas de microtitulação (1,5 x 104 células/poço) e cubra as placas. Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 18 - 20 h.
- Dia 2: ELISA
- Fixação de células
- Remova o meio das placas de microtitulação. Lave cada poço com 200 μL de PBS. Adicione 300 μL de acetona fria a 80% em cada poço e incube em temperatura ambiente por 10 min. Remova o fixador e deixe as placas secarem ao ar.
- Elisa
- Adição primária de anticorpos
nota: O anticorpo monoclonal NP antiinfluenza A deve ser usado em excesso como anticorpo primário no ELISA. Determine a diluição ideal de anticorpos para cada lote de anticorpos primários realizando titulações de anticorpos em MN. Selecione a concentração primária de anticorpos que está em excesso e com a melhor relação sinal-fundo.
- Diluir o anticorpo monoclonal NP anti-influenza A (anticorpo primário) até à concentração-alvo no diluente de anticorpos (por exemplo, adicionar 30 μL de anticorpo primário a 30 ml de diluente de anticorpos para uma diluição alvo de 1:1000).
- Lave as placas 3 vezes com 300 μL de tampão de lavagem. Adicione 100 μL de anticorpo primário diluído a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Adição de anticorpos secundários
NOTA: A imunoglobulina anti-camundongo de cabra, IgG conjugada à peroxidase de rabanete (HRP) deve ser usada em excesso como anticorpo secundário no ELISA. Determine a diluição ideal de anticorpos para cada lote de anticorpos secundários realizando titulações de anticorpos. Selecione a concentração de anticorpos secundários em excesso e com a melhor relação sinal-fundo.
- Diluir a IgG anti-ratinho de cabra conjugada com o anticorpo HRP (anticorpo secundário) até à concentração-alvo no diluente de anticorpos (por exemplo, adicionar 7,5 μL de anticorpo secundário a 30 ml de diluente de anticorpos para uma diluição alvo de 1:4000).
- Lave as placas 3 vezes com tampão de lavagem de 300 μL. Adicione 100 μL de anticorpo secundário diluído a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Adição de substrato e leitura de placas
- Lave as placas 5 vezes com tampão de lavagem de 300 μL e bata em um pano sem fiapos.
- Adicione 100 μL de substrato recém-preparado a cada poço e incube em temperatura ambiente até que o desenvolvimento da cor sature e a densidade óptica (OD) dos poços de controle celular <0,2.
- Adicione 100 μL de solução de parada a todos os poços. Leia o OD dos poços a 490 nm usando um espectrofotômetro de microplacas.
- Cálculo do TCID 50
- Calcular a DOmediana 490 dos comandos das células (coluna 12).
- Considere qualquer poço de teste com um OD490 maior que o dobro do OD490 médio dos poços CC como "positivo"; caso contrário, é considerado "negativo".
- Calcule o TCID50 do vírus usando o método Reed-Muench.
- Determine o número de pontos positivos e negativos em cada diluição.
- Calcule o "positivo cumulativo", "negativo acumulado", "Razão" e "% positivo" conforme ilustrado na Tabela 1.
- Calcule a "distância proporcional" entre a diluição mostrando >50% positivos e a diluição mostrando <50% positivos usando o seguinte:
nota: O fator de correção para 1/2 log de diluição é 0,5. Por exemplo, na Tabela 1: (80 − 50)/(80 − 20) x 0,5 = 0,25
- Calcule o TCID50 do vírus adicionando a distância proporcional à diluição mostrando > 50% positivo.
nota: Por exemplo, na Tabela 2, TCID50 é 10-5+(-0,25) = 10-5,25. NOTA: este é o TCID50 do vírus por 100 μL (ou 10-5,25 / 100 μL).
- Calcule a diluição do vírus. Para ensaios MN, diluir o vírus para 200 TCID50/100 μL (equivalente a 100 TCID50/50 μL por alvéolo).
nota: No exemplo da Tabela 1, 1 TCID50 é 10-5,25 em 100 μL, e a diluição para atingir 200 TCID50/100 μL é 1:891 com base nos cálculos: 200 x 10-5,25 = 10-2,95 = 1/102,95 = 1/891
5. Ensaio MN usando células MDCK-SIAT1
- Dia 1: Teste e controle a preparação dos soros e o layout da placa
- Descongelar o soro num banho-maria a 37 °C e retirá-lo imediatamente após a descongelação. Alíquota da quantidade de soros que deve ser ensaiada; é necessário um mínimo de 10 μL de soros originais para testar com um vírus num singleto. Se possível, testar os soros em duplicado.
- Inactivar o soro humano durante 30 minutos num banho-maria a 56 °C, como indicado no passo 1.12.1. Colocar soro no gelo após a inativação do calor e adicionar o diluente do vírus ao soro para obter uma pré-diluição de 1:10.
- Tratamento RDE e pré-diluição dos soros animais a 1:10 para uso em controles de acordo com 1.12.2.
nota: Os soros humanos e animais descongelados e tratados podem ser armazenados a 4 °C durante um período máximo de 24 horas. Os soros devem ser armazenados congelados a -20 °C ou mais frios se for necessário um período de armazenamento mais longo antes do ensaio.
- Para testar com um vírus, adicione 100 μL de soros diluídos a 1:10 nas colunas A1 a A10 (Figura 3). Adicionar 50 μl de diluente de vírus às linhas B a H, excepto nas colunas 11 e 12 (figura 3). Efectuar uma diluição em série de 2 vezes das linhas A a H e rejeitar os últimos 50 μL na linha H (figura 3).
nota: Quando vários vírus devem ser testados, os soros podem ser diluídos em tubos tituladores. A diluição do soro, para determinar o título sérico, no poço A é 1:10, poço B 1:20, poço C 1:40, poço D 1:80, poço E 1:160, poço F 1:320, poço G 1:640, poço H 1:1,280 (Figura 3).
- Para o controle do vírus, adicione 50 μL de diluente do vírus aos poços A12, B12, C12 e D12 (sem soro). Para o controle celular, adicione 100 μL de diluente de vírus aos poços E12, F12, G12 e H12 (sem vírus, sem soros).
- Para os soros de controlo (por exemplo, os controlos de soros de furões), adicionar 100 μl de soros de controlo diluídos à coluna 11 do alvéolo A e adicionar 50 μl de diluente de vírus aos alvéolos B11 - H11. Serial: diluir.
- Cubra as placas e incube a 37 °C, 5% de CO2 até que esteja pronto para a adição do vírus.
- Dia 1: Adição de vírus
- Diluir o vírus a 100 TCID50/50 μL com diluente de vírus.
- Adicione 50 μL de vírus diluído a todos os poços, exceto a coluna 11 nas placas de titulação reversa (BT) e os poços de controle celular E12, F12, G12 e H12 em todas as placas (Figura 3). Para as placas com soros de controlo na coluna 11, adicionar o vírus à coluna 11.
- Titulação reversa (BT)
- Inclua um BT na coluna 11 de um conjunto de placas duplicadas (por exemplo, placas 1A e 1B). Adicionar 50 μL de diluente de vírus a todos os alvéolos da coluna 11. Adicionar 50 μL do vírus a 100 TCID50/50 μL ao primeiro alvéolo (A11). Misture pipetando para cima e para baixo.
- Misture e transfira 50 μL para poços sucessivos para realizar diluições seriais de 2 vezes. Troque as pontas da pipeta entre os poços para evitar o transporte de vírus. Descarte 50 μL do poço H11.
- Adicione 50 μL de diluente de vírus à coluna 11 para elevar o volume final a 100 μL. Bata nas placas para misturar.
- Incubar as placas a 37 °C, 5% de CO2 por 1 h.
- Realize a adição de células MDCK-SIAT1 no dia 1 e ELISA no dia 2 conforme descrito nas etapas 4.2 e 4.3 (também descritas em 5.3 e 5.4)
- Dia 1: Adição de células MDCK-SIAT1
- Prepare as células MDCK-SIAT1 conforme descrito na etapa 4.2. Adicione 100 μL de células MDCK-SIAT1 a 1,5 x 105 células/mL a cada poço (1,5 x 104 células/poço). Incubar as placas a 37 °C, 5% de CO2 durante 18 - 20 h.
- Dia 2: ELISA
- Após a incubação durante a noite, no segundo dia, fixe as células com acetona fria a 80%, conforme descrito na etapa 4.3.
- Adição primária de anticorpos
- Lave as placas 3 vezes com tampão de lavagem de 300 μL. Diluir o anticorpo monoclonal NP anti-influenza A (anticorpo primário) até à concentração óptima determinada pela titulação no diluente de anticorpos (por exemplo, adicionar 30 μL de anticorpo primário a 30 ml de diluente de anticorpos para uma diluição alvo de 1:1000).
NOTA: São necessários 100 μL de anticorpo primário por poço. ~ 10 mL é necessário por placa.
- Adicione 100 μL de anticorpo primário diluído a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Adição secundária de anticorpos
- Lave as placas 3 vezes com tampão de lavagem de 300 μL. Diluir a IgG anti-ratinho de cabra conjugada com o anticorpo HRP (anticorpo secundário) até à concentração alvo no diluente de anticorpos (por exemplo, adicionar 7,5 μL de anticorpo secundário a 30 ml de diluente de anticorpos para um alvo 1:4000).
NOTA: São necessários 100 μL de anticorpo secundário por 96 poços. ~ 10 mL é necessário por placa.
- Adicione 100 μL de anticorpo secundário diluído a cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h.
- Adição de substrato e leitura de placas
- Lave as placas 5 vezes com tampão de lavagem de 300 μL e bata no lenço sem fiapos.
- Adicione 100 μL de substrato recém-preparado a cada poço e incube em temperatura ambiente até que os alvéolos de controle de vírus atinjam um OD490 = 0,8 - 3, com o controle celular em um OD defundo baixo 490 <0,2.
- Adicione 100 μL da solução de parada a todos os poços. Leia o OD dos poços a 490 nm usando um espectrofotômetro de microplacas.
- Análise dos dados
nota: Os cálculos de MN são determinados para cada placa individualmente.
- Determine o título de anticorpos neutralizantes de cada amostra de soro.
- Calcule o corte OD490 de 50% de neutralização do vírus para cada placa usando a seguinte equação:
nota: Aqui x = 50% do corte de neutralização. A diluição recíproca do soro correspondente à diluição mais alta com OD490 inferior a 50% do ponto de corte (inibição de ≥50%) é considerada o título de anticorpos de neutralização para essa amostra de soro (Figura 4).
- Verifique se os alvéolos de controle de células têm um OD490 <0,2 e os alvéolos de controle de vírus têm um OD490 = 0,8 - 3.
- Verificar a infecciosidade do vírus em cada ensaio (100x TCID50) pelo vírus BT. O intervalo aceitável de BT é de 50, 100 ou 200 TCID. Se estiver usando o mesmo ponto de corte definido na etapa 4.4.2, a maior diluição do vírus na coluna BT com DO acima do ponto de corte deve ser nos alvéolos E11, F11 e G11.
nota: Os controles séricos positivos devem fornecer títulos dentro de 2 vezes dos valores obtidos nos testes anteriores. A DO490 do controlo sérico negativo deve ser semelhante à observada para o controlo do vírus.
