Um ensaio de microneutralização para medir títulos de anticorpos neutralizantes em soro humano

Resumo

Fonte: Gross, F. L. et al., Medindo as respostas de anticorpos neutralizantes da gripe aos vírus A(H3N2) em soros humanos por ensaios de microneutralização usando células MDCK-SIAT1.J. Vis. Exp.(2017)

Este vídeo demonstra ensaios de microneutralização para medir anticorpos neutralizantes usando células renais caninas Madin-Darby que superexpressam ácido siálico ligado a α2,6 em soros humanos. Este ensaio é frequentemente usado para sorologia humana para influenza

Protocolo

Todos os vírus da gripe devem ser manuseados de acordo com os requisitos de nível de biossegurança apropriados (BSL-2 ou superior), conforme definido na Biossegurança em Laboratórios Microbiológicos e Biomédicos (BMBL).

1. Preparação de reagentes e material de partida

1. Preparar células Madine Darby Canine Kidney-α2,6-sial transferase (MDCK-SIAT1) e meio de cultura de células estéreis
   1. Prepare o meio de cultura de células MDCK-SIAT1 usando 500 mL de meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com glicose alta, 10% v / v de soro fetal bovino inativado por calor (FBS), 2 mM L-glutamina, 1....

Resultados

Figura 1. Cultura de células MDCK-SIAT1.Células MDCK-SIAT1. (A) Monocamada confluente MDCK-SIAT1 (>100% de confluência) para inoculação do vírus; (B) Células MDCK-SIAT1 na fase logarítmica com 75 - 95% de confluência para TCID₅₀ e ensaios MN.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio de Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco com alto teor de glicose	Ciências da vida	11965	Um componente crítico da cultura de células estéreis, propagação de vírus e meios diluentes de vírus
Soro fetal bovino (FBS)	Hyclone	SH30070.03
Albumina de soro bovino (BSA) Fração V, livre de protase	Sigma-Aldrich	3117332001
L-Glutamina	Ciências da vida	Rolamento 25030-081
Piruvato de sódio	Ciências da vida	Rolamento 11360-070
Sal dissulfato Geneticin G-418	Sigma-Aldrich	A1720-5G
HEPES	Ciências da vida	Rolamento 15630-080
Penicilina/estreptomicina	Ciências da vida	15140-122
acetona	VWR	67-64-1	Usado em uma concentração de 80%
Tampão de fosfato-citrato com perborato de sódio	Sigma-Aldrich	SLBF2806V
Comprimido de dicloridrato de O-fenilenodiamina	Sigma-Aldrich	SLBQ1086V	1 comprimido por 100ml de água de grau de cultura celular
ácido sulfúrico	Fisher Científico	A510-P500	Concentração final usada de 0,5 M
Etanol Desnaturado, 4L	VWR	EM-AX0422-3	Usado em uma concentração de 70%
Tripsina-EDTA	Ciências da vida	1748048
RDE II "Seiken"	Denka Seiken	370013
Pré-adolescente 20	Sigma-Aldrich	Pág. 1379-500ml
Ab monoclonal de camundongo anti-NP	Piscina Millipore	MAB 8257 MAB 8258
HRP IgG anti-mouse	KPL	Nº 074-1802
Placas de fundo plano de 96 poços	Thermo Científico	3455
Leitor de placas	Dispositivo molecular	Spectromax 384 plus
Frasco de cultura de células 162 cm2/tampa de ventilação	Corning/VWR	3151