Medindo a inibição induzida imunologicamente do crescimento de mudas

Resumo

Fonte: Bredow, M. et al., Ensaios de Inibição de Crescimento de Crescimento de Plântulas e Explosão Oxidativa Desencadeada por Padrão em Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

Este vídeo demonstra o ensaio de inibição do crescimento de plântulas na planta Arabidopsis thaliana. O impacto do aumento da concentração de peptídeo imune elicitor no crescimento das mudas é determinado.

Protocolo

1. Ensaio de inibição do crescimento de mudas

1. Esterilize as sementes e semeie em placas Murashige e Skoog (MS).
   1. Prepare meio MS estéril de meia concentração (0,5x) (2,16 g / L) contendo 0,8% de ágar [p / v]. Despeje a mídia em placas (90 x 15 mm) em uma capela de fluxo laminar.
   2. Esterilizar aproximadamente 100 sementes em tubo de microcentrífuga lavando com 1 mL de etanol a 70% por 2 min e remover por aspiração. Adicione 1 mL de alvejante a 40% e agite suavemente por 17 minutos em temperatura ambiente. Remova o alvejante por aspiração e lave três vezes em 1 mL de água estéril por 5 min. Ressuspender em 1 mL de ágar estéril a 0,1%
      nota: Alternativamente, use um protocolo de esterilização de sementes com gás cloro24.
   3. Semear aproximadamente 100 sementes por genótipo em placas de ágar MS usando uma pipeta e selar com fita micropore em uma capela de fluxo laminar.
      nota: Evite colocar sementes próximas, pois isso dificultará o transplante de mudas mais tarde.
   4. Estratificar as sementes colocando placas a 4 ° C (sem luz) por 3-4 dias para sincronizar a germinação (Figura 1A).
2. Transplante as mudas em placas de 48 poços contendo peptídeos elicitores imunológicos.
   1. Após a estratificação, mova as placas para a luz em condições de dias curtos (22 ° C, 10 h de luz, 150 μE / m² / s de intensidade de luz e 65-70% de umidade relativa) por 3-4 dias para permitir a germinação.
   2. Em uma capela de fluxo laminar, prepare diluições de peptídeos elicitores (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM e 1.000 nM) em meio líquido estéril 0,5x MS contendo 1% de sacarose [p / v], usando 25 mL de MS para cada placa de 48 poços. Prepare as placas pipetando 500 μL de meio líquido MS ou meio MS contendo peptídeos por poço. Se disponível, use um pipetador repetido para a preparação da placa para agilizar o processo.
      nota: Para cada genótipo, cultive mudas em MS sem elicitor para levar em conta quaisquer diferenças inerentes no crescimento das mudas.
   3. Usando uma pinça estéril, transplante cuidadosamente uma muda para cada poço do mesmo tamanho e idade, garantindo que não haja danos à muda ou quebra da raiz e que a raiz fique submersa no meio. Para cada genótipo, transplante um mínimo de 6-8 mudas em cada diluição peptídica (Figura 1B).
      nota: Transplante as mudas 4 dias após a germinação, pois as raízes curtas são mais fáceis de manipular e as mudas mais velhas podem produzir resultados menos ideais.
   4. Sele as placas com fita micropore e volte à luz em condições padrão de dias curtos (22 °C, 10 h de luz, 150 μE/m²/s de intensidade de luz e 65-70% de umidade relativa). Deixe as mudas crescerem por 8 a 12 dias.

2. Determine a porcentagem de inibição do crescimento.

1. Remova cuidadosamente as mudas de placas de 48 poços e seque-as enxugando-as em uma toalha de papel. Pese as mudas em uma balança analítica e registre os valores. Se disponível, use uma balança analítica equipada com saída USB para registrar os valores de peso fresco em uma planilha. Antes de pesar as mudas, tire uma foto para exibir visualmente a inibição do crescimento (Figura 1C).
2. Determine a porcentagem de inibição do crescimento de mudas tratadas com elicitor em comparação com mudas cultivadas em MS apenas da seguinte forma:
   
3. Plote os dados usando um gráfico de barras com barras de erro padrão ou usando um gráfico de caixa e bigode para exibir melhor a variância interexperimental.

Resultados

Figura 1. Ensaio de inibição do crescimento de plântulas induzido por elitor em Arabidopsis. (A) Semeie mudas em ágar MS e cresça por 3-4 dias em condições padrão de dias curtos. (B) Transplante as mudas para placas de 48 poços contendo meio MS ou MS contendo diferentes concentrações de elf18. (C) Após 8-12 dias, avalie visualmente o tamanho da muda e, em seguida, meça o peso fresco usando u...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas estéreis de 8 poços com tampa	Sigma-Aldrich	CLS3548
Balança analítica com sachid de inclinação	VWR	VWR-225AC	Qualquer escala analítica padrão pode ser usada para ensaios de inibição de crescimento, no entanto, uma saída direta do computador é ideal.
Pipeta Multicanal Mecânica BioHit mLine 12 (30-300 uL	Sartorius	Rolamento 725240	Qualquer pipeta multicanal pode ser usada, assim como uma única pipetadora, se necessário.
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZ Biolab	Rolamento CP7211	Armazene o peptídeo estoque de 10 mM a -80 graus C em tubos de baixa ligação a proteínas. Quando descongelado, armazene 100 uM de estoque de giro a -20 graus C.
Sais basais de Murisage e Skoog	Laboratórios Cedarlane	MSP09-100LT	Armazene a 4 graus C.
Placas de poliestireno branco de 96 poços	Fisher Científico	07-200-589