NOTA: O protocolo é aplicável a diferentes tecidos vegetais. Bainha de arroz e discos foliares foram usados neste protocolo para detecção de ROS após a elicitação de PAMP. Uma vez que as diferenças surgem principalmente devido ao método de amostragem, apenas os procedimentos comuns são descritos a seguir, sendo mencionadas etapas específicas sempre que necessário.
1. Preparação e pré-tratamento do tecido
- Bainha de arroz
- Corte a bainha de mudas de arroz de 10 dias em segmentos de 3 mm com uma lâmina de barbear afiada ou lâmina cirúrgica para pré-tratamento 1 dia antes do ensaio ROS (Figura 1B).
- Coloque cinco segmentos de bainha em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 μL de água bidestilada (ddH2O) por 10-12 h, no escuro a 25 °C, o que permite que o vazamento de íons relacionado à lesão da ferida e as respostas de defesa diminuam (Figura 2).
nota: Tomar cuidado para manter os cortes verticais para garantir uma área de superfície de corte consistente exposta à solução de elicitação é um passo importante para obter resultados altamente reprodutíveis. Mova os segmentos suavemente. Não faça cortes ou feridas extras nos segmentos, o que pode ser uma fonte de variação de dados. Em princípio, cada ensaio deve conter, pelo menos, cinco réplicas, uma vez que a variação do valor das ROS é grande. Quanto mais réplicas definidas, mais confiáveis são os dados.
- Disco foliar
- Corte os discos de folhas (4 mm de diâmetro) de plantas de arroz de 4-6 semanas usando um punção de biópsia com um êmbolo. Sempre corte os discos das folhas do terço médio da segunda folha (numerada a partir do topo) do perfilho principal para reduzir a variação dos dados (Figura 1C).
- Coloque um disco foliar em um poço individual de uma placa de microtitulação de 96 poços contendo 100 μL de ddH2O por 10-12 h para pré-tratamento, o que permite que as respostas relacionadas à ferida diminuam, pois podem interferir na indução de ROS por PAMPs (Figura 2).
nota: Opere os discos de folha suavemente. Não faça cortes ou ferimentos extras nos discos no experimento, o que pode resultar em variação de dados. A indução de ROS ocorre principalmente a partir das células da borda de corte, uma vez que as superfícies dos tecidos do arroz (folhas ou bainhas) são cobertas por camadas hidrofóbicas. Apenas as células das arestas de corte estão em contato com a solução de elicitação (consulte a seção de discussão).
- Mantenha todos os discos foliares flutuando, com a superfície abaxial voltada para cima, nos poços de uma placa de microtitulação para pré-tratamento de água para evitar variação associada ao lado da folha.
2. Preparando a solução de elicitação
- Dissolva o pó de L-012 em solução aquosa 20 mM (6,23 mg / mL) com ddH2O para fazer a solução estoque. Em seguida, diluir a solução-mãe com tampão Tris HCl 50 mM (pH 7,5) para fazer a solução de trabalho na concentração final de 500 μM L-012. Mantenha a solução de estoque congelada e dilua até a solução de trabalho antes de usar.
- Preparar a solução de elicitação contendo PAMP, L-012 e peroxidase de rábano (HRP; 10 mg/ml em ddH2O). Para uma solução de elicitação de 10 mL, misture 9,4 mL de solução de Tris HCl 50 mM (pH 7,5), 400 μL da solução L-012, 100 μL de HRP e 100 μL de flg22 (PAMP; 10 mM em ddH2O). Para o controle negativo, adicione 100 μL de ddH2O em vez de PAMP.
nota: Mantenha as soluções de elicitação preparadas à temperatura ambiente para evitar o estresse pelo frio nos tecidos do arroz. Outros PAMPs também podem ser usados para tratamento conforme necessário, como quitina (20 ng/mL na concentração final). Como o L-012 é sensível à luz, cubra todos os tubos contendo a solução de L-012 com papel alumínio.
3. Iniciando o software e configurando o protocolo com o leitor de microplacas referenciado (consulte a Tabela de Materiais)
NOTA: Leva algum tempo para configurar os parâmetros do software leitor de microplacas. Recomenda-se preparar a máquina e o protocolo (um clique para prosseguir) antes de adicionar a solução de elicitação.
- Inicie o software. Clique no botão Experimentos para criar um novo protocolo ou usar um protocolo existente.
- Clique em Procedimento no pop-up para configurar a placa. Selecione os poços da placa a ser monitorada.
- Clique em Iniciar cinética para configurar o tempo total de execução e o intervalo de leitura. Defina o tempo de execução como 35 min ou mais, dependendo dos requisitos experimentais. Para obter leituras com a maior frequência possível, selecione Intervalo mínimo. Para o tempo de integração, escolha 1 s ou mais, dependendo da intensidade do sinal.
NOTA: O intervalo de leitura depende do número de amostras e da duração da integração do sinal.
- Clique em Validar | OK para confirmar as configurações.
- Clique em Detectar a nova placa no pop-up e aguarde até que o software solicite a caixa de diálogo da placa de carga. Coloque a placa a ser testada no suporte.
- Pare aqui para esperar que o sistema de elicitação seja estabelecido (na próxima seção). Assim que o sistema de elicitação estiver pronto, clique em Executar para iniciar a leitura.
4. Estabelecer o sistema de elicitação e medir a produção de ROS em tempo real
- Remova cuidadosamente o ddH2O dos alvéolos que contêm os tecidos pré-tratados, evitando qualquer dano tecidual ou dessecação.
- Use uma pipeta multicanal para adicionar 200 μL da solução de elicitação aos poços que contêm os tecidos.
- Agite suavemente para misturar. Clique em Executar para iniciar a detecção.
nota: Com o tratamento com PAMP, os tecidos vegetais respondem e produzem ROS muito rapidamente. Portanto, sugere-se que o controle negativo sem PAMP seja tratado primeiro para reduzir o tempo de operação quando houver múltiplos tratamentos. Opere o mais rápido possível para reduzir o atraso de provocação entre os tratamentos. Quanto menor o tempo entre a adição da solução de elicitação e o início da detecção, melhor será a captura de dados experimentais importantes.
