Todos os procedimentos que envolvem a coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.
1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico
- Obter sangue total humano de um doador saudável ou de um paciente por punção venosa usando vacutainers contendo anticoagulante ácido-citrato-dextrose (ACD) (tubos de topo amarelo).
nota: O sangue total pode ser armazenado na DAC à temperatura ambiente (18-22 °C) por até 36 horas antes de prosseguir para a próxima etapa. Normalmente, 1-2 tubos vacutainer de 10 mL de sangue total são suficientes para o ensaio.
- Dilua o sangue total 1:1 v/v em meio RPMI completo quente (RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 20 mM de HEPES e 0,01 mg/mL de gentamicina).
- Isole as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) do sangue total diluído usando centrifugação por gradiente de densidade, conforme recomendado pelo fabricante (consulte a lista de materiais). Coloque o sangue diluído muito lentamente sobre o gradiente de densidade (aquecido à temperatura ambiente, 18-22 °C).
nota: Minimize a quantidade de mistura na interface para a separação ideal do sangue, colocando cuidadosamente a mistura de sangue em camadas gota a gota ou usando uma pipeta.
- Permita que a mistura de sangue se espalhe lentamente por cima do gradiente de densidade, colocando a ponta da pipeta perto do gradiente de densidade e permitindo que a mistura de sangue escorra pela lateral do tubo muito lentamente.
- Dependendo da escala do experimento, coloque 10 mL de mistura de sangue em cima de 3 mL de gradiente de densidade (em um tubo de 15 mL) ou camada de 35 mL de mistura de sangue em cima de 15 mL de gradiente de densidade (em um tubo de 50 mL). Normalmente, 10 mL de sangue total produzem 10 milhões de PBMCs, com alguma variação de doador para doador.
nota: É muito importante que não haja mistura da mistura de sangue com o gradiente de densidade. A mistura de sangue deve se sobrepor ao gradiente de densidade e subir lentamente até que todo o sangue esteja no topo do gradiente de densidade.
- Centrifugue a mistura em camadas a 700 x g por 30 min sem freios. A mistura centrifugada deve ser separada em 5 camadas (de cima para baixo): plasma, buffy coat (contendo PBMCs), material de gradiente de densidade, granulócitos e hemácias.
- Remova e descarte a maior parte do plasma e recupere cuidadosamente o conteúdo do revestimento leucocitário (PBMC) em um novo tubo de 15 mL usando uma pipeta Pasteur e um bulbo de sucção.
nota: A remoção da camada de buffy coat é feita efetivamente aplicando sucção na pipeta Pasteur enquanto realiza um movimento circular ao redor da parte externa da camada, com a ponta da pipeta contra o tubo.
- Lave os PBMCs isolados três vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,3 centrifugando a 350 x g por 10 min (com freios completos) entre as lavagens. Reconstitua o pellet PBMC em meio RPMI completo. Dependendo do tamanho do pellet, 3-7 mL de meio são suficientes.
- Contar o PBMC utilizando azul de tripano e um hemocitômetro. Conte apenas as células que não estão coradas pelo azul de tripano. Reconstitua os PBMCs em 1.750.000 células/mL em um meio RPMI completo.
- Semeie 400 μL (700.000 células) em cada poço de uma lâmina de 8 câmaras. Incubar a lâmina numa incubadora de cultura de tecidos a 37 °C, totalmente humedecida (suplementada com 5% de CO2) durante 1 h para permitir a adesão dos monócitos/macrófagos.
2. Pré-tratamento de Monócitos Aderidos
NOTA: Esta etapa só é necessária se estiver procurando maneiras de inibir ou aumentar a fagocitose.
- Pré-trate os monócitos aderidos com qualquer medicamento ou composto de interesse. Reconstitua o(s) medicamento(s) ou outro material de teste na concentração desejada usando um meio RPMI completo.
nota: Por exemplo, 200 μg/mL de IVIG são normalmente usados para produzir uma inibição de 95-100% da fagocitose ao usar monócitos humanos.
- Aspirar e rejeitar o sobrenadante que contenha quaisquer células não aderentes da lâmina de 8 câmaras após a incubação de 1 h (após o passo 1.6). Substitua-o por 400 μL de um medicamento ou outro tratamento e incube por 1 h a 37 °C.
- Ao aspirar e substituir soluções na lâmina de 8 câmaras, certifique-se de controlar o fluxo dos fluidos para que as células fracamente aderidas não se levantem. Além disso, trabalhe com apenas 2-3 poços vazios por vez e evite secar os poços.
nota: Normalmente, cada tratamento é realizado em triplicados técnicos.
3. Opsonização de glóbulos vermelhos R2R2
NOTA: As hemácias R2R2 opsonizadas são usadas como controle positivo para fagocitose mediada por FcγR. O Naïve R2R2 deve ser conservado na solução de Alsever (para prolongar o prazo de validade) a 4 °C durante um período máximo de 1 mês. A solução de Alsever é fabricada internamente e composta por 0,8% p/v de citrato trissódico (di-hidratado), 1,9% p/v de dextrose, 0,42% p/v de cloreto de sódio e 0,05% p/v de ácido cítrico (monohidratado). Se as células R2R2 não estiverem disponíveis, outras células fenotipadas com Rh, como R1R2, R1R1, R1r ou R2r, podem ser usadas.
- Lave os glóbulos vermelhos R2R2 (cDE/cDE) em PBS um total de três vezes usando centrifugação a 350 x g por 5 min cada.
nota: A quantidade de hemácias necessárias depende do tamanho do experimento e pode ser calculada retroativamente. Sempre lave uma quantidade excessiva de hemácias, pois as hemácias são perdidas durante cada lavagem devido à lise ou durante a remoção do sobrenadante. Por exemplo, em um experimento com 5 tratamentos e 2 controles, todos conduzidos em triplicatas técnicas, há um total de 21 poços. 21 poços com 400 μL/poço de mistura de hemácias a 1,25% indicam que são necessários 105 μL de hemácias compactadas e opsonizadas. 200 μL de hemácias devem ser inicialmente lavados e 150 μL devem ser opsonizados para garantir que haja uma quantidade adequada de hemácias para a etapa de fagocitose.
- Opsonize o pellet R2R2 lavado com anticorpos anti-D policlonais 1:1 v/v de soro humano e incube por 1 h a 37 °C, com mistura intermitente.
nota: Se os anticorpos anti-D policlonais não estiverem disponíveis, é possível usar anticorpos anti-D monoclonais, que estão disponíveis comercialmente, ou anti-D, que são normalmente usados para profilaxia imunológica Rh, que podem ser obtidos em bancos de sangue ou serviços de transfusão. O teste de otimização deve ser realizado no início da configuração do ensaio e sempre que trocar muitos anticorpos policlonais não titulados ou mudar para um anticorpo monoclonal. Isso é para identificar a concentração ou volume ideal de anti-D necessário para um resultado de teste de antiglobulina (IAT) entre 3+ e 4+ e um resultado de fagocitose entre 70-90 hemácias fagocitadas por 100 monócitos contados.
- Lave o opsonizado R2R2 um total de três vezes em PBS usando centrifugação a 350 x g por 5 min cada.
nota: A opsonização bem-sucedida de R2R2 pode ser confirmada pela realização de um IAT indireto. Resumidamente, anticorpos anti-humanos policlonais secundários são adicionados para ligar anticorpos opsonizantes primários nas superfícies das hemácias, e o sinal amplificado pode ser observado na forma de hemaglutinação. Um protocolo detalhado do fabricante pode ser encontrado no arquivo de materiais suplementares.
- Reconstitua o pellet R2R2 lavado a 1,25% v/v usando um meio RPMI completo.
nota: O excesso de R2opsonizado pode ser conservado na solução de Alsever a 4 °C durante uma semana.
4. Fagocitose mediada por receptor Fc
- Aspire o medicamento ou sobrenadante médio da lâmina de 8 câmaras e adicione 400 μL da mistura a 1,25% v / v R2R2. Incubar a 37 °C durante 2 h.
- Após 2 h de incubação, remova as câmaras usando os adaptadores do fabricante. Enxugue o excesso de R2R2 em uma toalha de papel. Certifique-se de que a lâmina não seque.
- Encha um copo de 100 mL com PBS. Mergulhe e lave a lâmina movendo-a lentamente para frente e para trás (cerca de 30-40 golpes) para remover a maior parte do R2R2 não fagocitado.
- Remova o slide do PBS. Enxugue o excesso de PBS usando uma toalha de papel ou lenço de papel e seque a lâmina ao ar.
- Fixe a lâmina seca ao ar em 100% de metanol por 45 s. Em seguida, seque ao ar a lâmina fixa.
nota: As lâminas podem ser fixadas usando outro método mais compatível com a coloração a jusante, como a coloração de Grünwald-Giemsa21 ou a coloração de Wright-Giemsa.
- Monte o slide usando um meio de montagem Elvanol feito internamente (ou outro meio de montagem disponível comercialmente) e adicione lamínulas.
nota: O meio de montagem Elvanol é composto por 15% p/v de resina de álcool polivinílico e 30% v/v de glicerina em PBS. A mistura é aquecida até que toda a resina se dissolva e a glicerina seja homogeneamente misturada. Isso pode ser substituído por outro meio de montagem disponível comercialmente.
- Deixe o suporte secar durante a noite antes da quantificação.
5. Quantificação da fagocitose
- Usando um microscópio de contraste de fase e uma lente objetiva de 40X, quantifique manualmente a quantidade de eventos fagocíticos contando pelo menos 200 monócitos e o número de R2R2 fagocitados dentro desses monócitos. Ter um contador em cada mão para quantificar simultaneamente o número de monócitos e o número de fagocitados R2R2.
- Obter o índice fagocítico médio dividindo o número de fagocitados R2R2 pelo número de monócitos e multiplicando por 100. Expresse os dados como a média (índice fagocítico médio) ± o erro padrão da média (EPM).
